4.2. Условия содержания животного во время проведения эксперимента регламентируются Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Животное должно быть обеспечено водой для питья и нормальным питанием. В целях унификации условий исследований животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион, составленный согласно МУ 1.2.2520-09.

4.3. Определение способа (метода) введения наноматериалов.

Способ введения наноматериала определяется целями исследования, а также его планируемой продолжительностью. Данный параметр эксперимента определяет перечень органов, подлежащих обязательному исследованию. При выборе пути введения следует также учитывать, что количество вводимых растворов, которое определяет предельно допустимую нагрузку, ограничивается рамками физиологических возможностей, массой и возрастом животных (табл. 2).

Таблица 2

МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМЫЕ ОБЪЕМЫ РАСТВОРОВ (МЛ) ДЛЯ НЕКОТОРЫХ

ВИДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПУТИ ВВЕДЕНИЯ

4.3.1. Парентеральное (внутривенное и внутрибрюшинное) введение применяют для краткосрочных экспериментов, изучающих непосредственное воздействие наночастиц на ткани организма. При внутривенном введении наночастицы поступают непосредственно в кровь и накапливаются преимущественно в органах, обеспечивающих фильтрацию и детоксикацию крови (почки, печень), а также иммунную защиту. При внутрибрюшинном (интраперитонеальном) введении, помимо воздействия, оценивается также способность частиц проникать в кровяное русло с лимфой. Соответственно, при проведении экспериментов этого типа в обязательном порядке инспектируют состояние перитонеальных лимфатических узлов.

Парентеральное введение наночастиц осуществляют в виде их дисперсии в физиологическом растворе. Для получения дисперсий следует использовать физические методы (встряхивание, перемешивание, обработка ультразвуком, гомогенизация путем продавливания через иглы малого диаметра). Использование в качестве носителей наночастиц органических растворителей и поверхностно-активных веществ не допускается. Введение наночастиц может осуществляться как однократно, так и многократно, с не менее чем суточными интервалами, в зависимости от задач тестирования.

Для прогнозирования вероятности и последствий проникновения наночастиц в организм в естественных условиях (например, при промышленном загрязнении объектов окружающей среды), а также для установления зависимости степени патологического воздействия частиц от способа введения парентеральные способы введения наночастиц не применяются.

4.3.2. Пероральное и внутрижелудочное введение наночастиц позволяет изучить как проницаемость стенки пищеварительного тракта для конкретного типа наночастиц, так и их возможное патологическое воздействие на ткани организма. Оценка специфических изменений обязательно включает анализ состояния тканей тонкого кишечника и перитонеальных лимфатических узлов. Выбирая между добровольным и принудительным введением, важно учитывать, что при свободном поступлении наночастиц с пищей или питьевой водой не удается осуществлять контроль дозировки и единовременное введение больших количеств вещества. Более эффективной является модель принудительного введения через желудочный зонд, внутрижелудочный или внутрикишечный катетер или фистулу (при наличии соответственным образом подготовленных животных). Наноматериалы в виде раствора, взвеси, эмульсии в нетоксичном растворителе вводятся в желудок животных через специальный зонд при помощи шприца. Вводимый объем не должен превышать предельно допустимый для животных данного вида в зависимости от массы тела. Перед процедурой введения и после нее животные не должны получать пищу в течение 2-3 часов. Дозу полученных животными наночастиц выражают через массу препарата в пересчете на единицу массы тела животного (мг/кг массы тела).

При получении дисперсий наночастиц следует использовать физические методы диспергирования. В качестве носителя для наночастиц используется дистиллированная вода, физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер. Использование дисперсий наночастиц в органических растворителях и растворах ПАВ не допускается. В порядке исключения допускается применение носителей наночастиц, обладающих собственной токсикологической характеристикой, которая должна быть охарактеризована в дополнительных группах животных, получающих эти носители в количествах, эквивалентных вводимым животным опытных групп.

Пероральное и внутрижелудочное введение наночастиц может осуществляться в остром опыте (однократно), как, например, при тестировании острой токсичности согласно МР 1.2.2522-09, в подостром опыте (ежедневно на протяжении 30-90 дней) и хронически (на протяжении всей жизни животного, что составляет для мышей и крыс 2,0-2,5 года).

4.3.3. Эпикутанное нанесение наночастиц позволяет оценить проницаемость покровов тела для наночастиц, их способность кумулироваться в организме и вызывать специфические патологические изменения при трансдермальном поступлении. Данный тип введения применим в остром, подостром и хроническом эксперименте. Область аппликации препарата наночастиц должна быть стандартной и составлять 5-8% поверхности тела животного. У мышей выстригается поверхность тела площадью от 3 до 5 кв. см, у крыс - от 15 до 24 кв. см, у морских свинок - от 25 до 42 кв. см, у кроликов - от 56 до 88 кв. см. Дозу полученного животным препарата наночастиц оценивают в пересчете на единицу площади тела животного (мг/куб. м). При выявлении специфических эффектов воздействия наночастиц в обязательном порядке проводят исследование фрагмента кожи в области аппликации препарата наночастиц, а также прилежащих лимфатических узлов. При использовании дисперсий наночастиц в носителе, обладающем собственной эпикутанной токсичностью (растворы ПАВ, органические растворители), животных контрольной группы подвергают обработке носителем в эквивалентной дозе.

4.3.4. Ингаляционный способ введения применяется как в острых, так и в хронических экспериментах по изучению воздействия наночастиц на организм. При ингаляционном введении лабораторных животных помещают в затравочные камеры, снабженные специальными затравочными устройствами, либо применяют эндотрахеальное, внутриглоточное или внутригортанное ингаляционное введение с использованием специальных зондов. В таких исследованиях обязательно анализируют состояние ткани легких, уделяя повышенное внимание оценке состояния их респираторного отдела. Ингаляционное воздействие может проводиться в условиях острого (однократно, на протяжении суток), подострого и хронического воздействия. Экспозицию вводимых наночастиц при ингаляционной затравке характеризуют их концентрацией (выраженной через массу наноматериала, площадь поверхности или число частиц в единице объема вдыхаемого воздуха), помноженной на время ингаляции (в часах или сутках). При эндотрахеальном, внутриглоточном или внутригортанном введении дозу наноматериала выражают так же, как и при пероральном и внутрижелудочном введении.

4.4. Определение численности и характеристик экспериментальных групп животных.

Количество животных в группе определяется целями исследования, но не должно быть менее 10 особей в группе. В исследование включают здоровых животных одного пола и возраста. Вариативность исходной массы тела животных в группе не должна превышать +/- 10%.

В целях наиболее полной оценки действия наноматериалов на лабораторных животных следует изучить влияние таких факторов, как пол, возраст, беременность, лактация, для чего в опыт включают несколько экспериментальных групп. Каждая группа формируется из животных, строго соответствующих заданному физиологическому критерию.

4.5. Формирование контрольных групп животных.

Контрольные группы формируются с целью достоверной оценки значимости данных, полученных в ходе эксперимента на подопытных животных. Вид (порода), пол, возраст, средняя масса, численность и условия содержания животных контрольной группы должны совпадать с этими показателями в подопытной группе. Животным контрольной группы вводят только носитель вещества, который используется для введения наночастиц подопытным животным.

В экспериментах с использованием потенциально токсичного носителя рекомендуется также включать в исследование интактную контрольную группу животных. При проведении экспериментов с эпикутанным нанесением препарата наночастиц практикуют одновременную аппликацию носителя на участки кожи животного, которые расположены симметрично обработанным. Эти участки служат контролем, который позволяет оценить индивидуальный разброс реакций в подопытной группе как на препарат, так и на носитель. В исследованиях, нацеленных на оценку изменения уровня воздействия наночастиц в зависимости от их размера и формы, формируется референтная контрольная группа животных, получающих традиционный аналог наноматериала (при его наличии).

4.6. Расчет доз вводимых наноматериалов.

    Дозы  введения  наноматериала  при  остром  воздействии  составляют  от

минимальной  токсической  дозы  до  1  LD  , при подостром воздействии - от

                                         50

минимальной токсической дозы до 1/5 LD  , при  хроническом  воздействии  от

                                      50

1/3 до 1/10 части минимальной токсической дозы.

Экстраполяцию полученных патофизиологических данных на человека производят методом перерасчета доз на единицу массы тела, после чего вводится X-кратный коэффициент запаса, учитывающий степень неопределенности в экстраполяции данных применяемой экспериментальной модели.

V. Критерии оценки действия наноматериалов на лабораторных

животных по морфологическим признакам

5.1. Особенности исследований некоторых органов и систем

После планового завершения экспозиционной фазы эксперимента животных умерщвляют гуманным способом в соответствии с требованиями, изложенными в МУ 1.2.2520-09. Вскрытие проводят согласно правилам надлежащей лабораторной практики. В ходе аутопсического исследования последовательно визуально оценивают состояние легких, сердца, аорты, желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, поджелудочной железы, почек, семенников и простаты или яичников, селезенки, лимфатических узлов, тимуса, щитовидной железы, надпочечников, гипофиза, головного мозга, кожи (перечень органов может быть сокращен или расширен в зависимости от задач эксперимента). Для выявления специфических патологических изменений, вызванных наночастицами, проводят морфометрический анализ и исследование органов на макроскопическом и микроскопическом уровнях в сравнении с нормой (контролем).

Гистоморфологическое исследование легких должно быть в обязательном порядке включено в эксперименты, в которых наночастицы вводятся животным ингаляционно либо интратрахеально. При ином пути введения также возможно накопление наночастиц в легочной ткани в результате проникновения с кровотоком. Кумуляция частиц происходит преимущественно в легочных макрофагах. В ходе макроскопического исследования легких необходимо обращать внимание на анатомические изменения органов, которые могут являться следствием развития специфических патологических процессов, в частности, бронхоэктазы, фиброзные или деструктивные изменения легочной ткани и т.п. При гистоморфологическом исследовании ткани легкого устанавливают состав клеточной популяции и наличие патологически измененных типов клеток. На субмикроскопическом уровне оценивают такие характеристики, как размер и форма клеточного ядра, гранулярность и вакуолизация цитоплазмы и т.п. Отмечают любые признаки, указывающие на структурно-функциональную дезорганизацию клеток. При развитии патологических процессов в ткани легких могут наблюдаться специфические многоядерные клетки воспаления, имеющие родственное с макрофагами моноцитарное происхождение - гигантские клетки инородных тел, а также клетки Пирогова-Лангерганса.

Детальное исследование тканей сердца проводят с целью определения влияния наночастиц на поперечно-полосатую мышечную ткань. Уровень кумуляции наночастиц в ткани сердца зависит от их размера. Крупные наночастицы (> 30-50 нм) обладают ограниченной проникающей способностью и, как правило, накапливаются в сердце в небольшом количестве. При хронических воспалительных процессах в миокарде можно наблюдать так называемые клетки Анничкова с характерным расположением ядерного хроматина в виде зубчатой полоски, проявляющие фагоцитарную активность. Кровеносные капилляры являются наиболее подходящим объектом для исследования влияния наночастиц на кровеносную систему, так как непосредственно контактируют с циркулирующими наночастицами еще до проникновения их в фильтрующие системы органов. Особо изучают состояние аорты, как наиболее крупного артериального сосуда системы кровообращения. При аутопсии на макроскопическом уровне могут быть выявлены склеротические изменения стенок, кальциноз, очаги некроза и т.п. При гистоморфологическом исследовании кровеносных сосудов анализируют клеточный состав ткани, обращая внимание на инфильтрующие стенку сосуда элементы крови (лимфоциты, моноциты-макрофаги, тучные клетки). Стоит отметить, что несмотря на формальное структурное сходство, крупные сосуды млекопитающих разных видов имеют существенные гистологические отличия. Так, внутренняя оболочка артерий мышей представлена только эндотелием и подлежащей тонкой прослойкой соединительнотканного матрикса, который практически не содержит клеточных элементов, свойственных многослойной интиме артерий человека.

При пероральном или внутрижелудочном введении полые органы пищеварительного тракта (желудок, кишечник) непосредственно контактируют с препаратом наночастиц, что диктует целесообразность их тщательного гистологического исследования. Печень является обязательным объектом исследования при проведении медико-биологической оценки действия наночастиц на организм лабораторных животных, что связано с детоксицирующей функцией этого органа. Помимо того, к настоящему времени накоплено большое количество данных о преимущественной кумуляции наночастиц некоторых типов в тканях печени. Поджелудочная железа не является мишенью наиболее вероятного накопления наночастиц, однако может интересовать исследователя с точки зрения специфических воздействий наноматериалов на различные ткани и органы лабораторных животных.

В связи с экскреторной функцией почек, наличие патологических изменений в них оценивают вне зависимости от выбранного способа введения наночастиц. Накопление в почках в большей степени свойственно наночастицам малого размера. Чрезвычайно интенсивная почечная гемодинамика (например, у крыс - свыше 70 мл/мин. на 100 г) создает предпосылки для накопления наночастиц в тканях почек, чем обусловлена высокая вероятность развития в них патологических процессов. Основной объем почечного кровотока приходится на корковое вещество, в связи с чем можно ожидать концентрирования наночастиц в корковых структурах. Принимая это во внимание при изучении эффектов прямого воздействия наночастиц, не следует, однако, исключать возможность сопутствующих специфических изменений и в тканях мозгового вещества.

Среди органов иммунной системы следует особо выделить тимус, селезенку и лимфатические узлы. Тимус (вилочковая железа) представляет собой лимфоидный орган, в котором происходит созревание, дифференцировка и иммунологическое "обучение" T-клеток иммунной системы. Размеры железы в постнатальном периоде возрастают и достигают максимума (у белых крыс - в возрасте трех месяцев), а затем снижаются вследствие возрастной инволюции и атрофии. Тимус отделен от кровеносного русла многослойным гематотиматическим барьером, относительно слабо проницаемым для наночастиц, циркулирующих в крови. Исходя из этого обстоятельства, изучение ткани тимуса следует планировать либо в рамках расширенного исследования, включающего анализ всех органов животного, либо в экспериментах, нацеленных на оценку уровня проницаемости естественных барьеров организма, в т.ч. гематоэнцефалического. В настоящее время накоплено большое количество данных о кумуляции наночастиц в тканях селезенки, ввиду чего представляется необходимым включить этот орган в стандартный план исследования воздействия наноматериалов на организм лабораторных животных. Селезенка является самым крупным органом периферической лимфоидной системы, который обеспечивает антиген-зависимую дифференцировку лимфоцитов. В селезенке происходят антиген-зависимая пролиферация и дифференцировка T- и B-лимфоцитов и образование антител, а также выработка веществ, угнетающих эритропоэз в красном костном мозге. Исследование ткани лимфатических узлов рекомендуется проводить, в первую очередь, в экспериментах по изучению воздействия наночастиц при их интраперитонеальном и пероральном введении животным. Лимфатические узлы являются важными органами лимфоцитопоэза, иммунной защиты и депонирования циркулирующей лимфы. Функционально лимфатический узел является барьером на пути потенциальных патогенов из лимфатического русла в кровеносное.

5.2. Оценка действия наноматериалов

по качественным показателям

5.2.1. Макроскопический уровень

При исследовании органов на макроскопическом уровне проводится взвешивание органа и его внешний осмотр.

Ниже перечислены характерные признаки патологических изменений, которые могут быть вызваны воздействием наноматериалов:

а) существенное отклонение массы органа от физиологической нормы (физиологическая норма определятся на основании усредненных данных взвешивания органов животных контрольной группы либо на основании данных литературы по данной линии животных с учетом их пола и возраста);

б) изменение естественной окраски органа (например, в результате воспалительного процесса);

в) наличие некротических изменений в ткани органа или его соединительнотканной капсулы;

г) наличие доброкачественных либо злокачественных опухолей различной локализации;

д) нарушение целостности оболочки органа либо сращение ее с оболочками других органов;

е) изменение консистенции органа, обусловленное изменениями в его внутренней структуре (воспалительные процессы, дистрофии и т.д.).

Все данные, полученные в ходе вскрытия и изучения органов на макроскопическом уровне, тщательно протоколируют.

5.2.2. Светооптический уровень

Исследование методами световой микроскопии подразумевает определение наличия/отсутствия и, при обнаружении, оценку степени специфических гистопатологических изменений в органах и тканях. Известно, что многие наночастицы способны повреждать клетки организма, а также вызывать генерацию активных форм кислорода лейкоцитами различных типов, провоцируя развитие местных или системных воспалительных процессов. В свою очередь, развитие интенсивного воспалительного ответа также способно приводить к значительным повреждениям тканей в результате выделения ряда ферментов, клеточных факторов и генерации активных форм кислорода. В зависимости от тяжести воздействия возможен переход от острого воспалительного процесса к пролиферации и регенеративным изменениям в ткани, а в случае длительного воздействия - развитие хронического воспаления. Типичным исходом обширного воспалительного процесса являются фиброзные изменения соединительной ткани.

Ниже приведен примерный перечень критериев оценки прямого или опосредованного воздействия наноматериалов на ткани:

а) Нарушение целостности оболочки гемокапилляров - полное или частичное повреждение эндотелия и базальной мембраны.

Микропрепараты тканей исследуют на предмет наличия в них поврежденных сосудов микроциркуляторного русла. Поврежденным считается сосуд с явными нарушениями структуры эндотелия и целостности базальной мембраны (исключение - синусоидные капилляры). Критериями оценки являются степень повреждения сосуда и наличие инфильтрата в окружающей сосуд ткани.

б) Наличие нейтрофильной инфильтрации тканей и ее характеристика.

Выявляют присутствие в ткани инфильтрирующих ее нейтрофильных гранулоцитов. Визуально регистрируемое повышенное содержание гранулоцитов в ткани является одним из признаков проходящего в ткани острого или хронического воспалительного процесса. Определяют количество инфильтрирующих ткани клеток на единицу площади, в случае наличия очагов повышенной инфильтрации оценивают площадь очагов.

в) Инфильтрация тканей мононуклеарными фагоцитами и ее характеристика.

Определяют количество макрофагов, моноцитов и гигантских клеток инородных тел в области анализа. Наличие в ткани значительного числа моноцитарных клеток свидетельствует о протекании острой фазы воспалительного процесса. Зрелые макрофаги, как правило, указывают на развитие воспалительного процесса в сторону регенерации или хронического воспаления. Отдельно оценивают наличие ГКИТ и/или клеток Пирогова-Лангерганса, которое является признаком хронического воспалительного процесса средней или высокой интенсивности. В случае их обнаружения определяют количество патологических клеток на единицу площади.

г) Увеличение количества апоптирующих клеток ткани органа (апоптического индекса).

д) Увеличение количества некротических клеток.

е) Патологические изменения цитоархитектоники органов, фиброзы.

ж) Существенные изменения клеток органа - жировая дистрофия, гемосидероз и т.п.

На основании комплексного исследования оценивают тяжесть дистрофических изменений в ткани. Например, в жировой дистрофии ткани печени выделяются следующие стадии:

простое ожирение, при котором не выражена деструкция гепатоцитов и отсутствует клеточная реакция;

ожирение в сочетании с некрозом отдельных гепатоцитов и мезенхимально-клеточной реакцией;

ожирение гепатоцитов, некроз отдельных гепатоцитов, клеточная реакция и разрастание соединительной ткани с начинающейся перестройкой дольковой структуры печени.

При исследовании препаратов на светооптическом уровне для повышения контрастности изображения и выявления специфических структур применяют гистохимическое окрашивание. К числу наиболее распространенных методов относятся окраска гематоксилином-эозином (дифференциальное контрастирование базофильных и эозинофильных структур), суданом III (обнаружение жировых капель). Для решения специальных задач конкретного эксперимента следует применять расширенный набор методик, принятых в лабораторной практике.

5.3. Оценка действия наноматериалов на организм животных

с использованием методов морфометрии

5.3.1. Характеристика морфометрических методов

Морфометрия включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. В качестве объектов анализа используют изображения гистологических препаратов (срезов, мазков, отпечатков). К списку параметров, подлежащих оценке, относятся размеры, размещения, количественные соотношения, очертания микроскопических морфоструктур. Численное представление результата в сочетании с применением методов статистической обработки позволяет проводить достоверное сравнение образцов по выделенному признаку.

Получение гистологических изображений осуществляют при помощи светового микроскопа, оборудованного цифровой фотокамерой. Для обеспечения достоверности данных при определении каждого параметра проводят серию дублирующих измерений. Анализу подвергают репрезентативные микрофотографии, полученные при увеличении х400 или х1000. Выборка должна включать не менее 50 микрофотографий.

Измерение числа структур, их площадей, диаметров, периметров и других количественных показателей производят с помощью специализированного программного обеспечения. Выполняя статистическую обработку результатов, вычисляют выборочное среднее и стандартное отклонение.

    При  исследовании  ткани  на  предмет  воспалительных изменений анализу

подлежит,  в  первую очередь, количество инфильтрирующих ткани лейкоцитов и

                                                              4

клеток   соединительной   ткани   на   единицу   площади   (10   кв.  мкм),

сгруппированных по следующим типам:

а) нейтрофильные гранулоциты (характерны для ранних стадий острого воспалительного процесса);

б) моноциты;

в) макрофаги;

г) ГКИТ и клетки Пирогова-Лангерганса (клетки, указывающие на наличие хронических воспалительных процессов в ткани);

д) лимфоциты.

В случае, если в области инфильтрации обнаруживаются явные визуальные отклонения от нормы в популяциях клеток иных типов, они также должны быть включены в морфометрический анализ. При обнаружении существенных различий в уровне инфильтрации гистологически обособленных зон одного органа (к примеру, корковое и мозговое вещество почек) данные по этим зонам оценивают независимо.

При выявлении выраженных очагов повышенной инфильтрации лейкоцитами оценивают отношение площади очагов к общей площади ткани органа, в которой они встречаются. Частоту повреждения эндотелия капилляров определяют как отношение числа капилляров с целыми стенками к общему числу капилляров в исследуемой ткани.

Гистопатологические изменения в тканях могут проявляться в виде нарушения механизмов клеточной гибели. Морфометрически такие изменения выявляются при оценке следующих показателей:

а) доля некротически поврежденных клеток среди клеток данного типа;

б) доля апоптических клеток среди клеток данного типа;

в) доля клеток с патологическими изменениями ядер (пикноз, кариорексис, микроядра) среди клеток данного типа;

г) митотический индекс для конкретного типа клеток (опционально).

В ходе морфометрического исследования дистрофических и других патологических изменений тканей оценивают степень их выраженности. Например, при изучении ткани печени определяют следующие показатели уровня дистрофических и/или противовоспалительных изменений:

а) отношение площади жировых включений в цитоплазме гепатоцитов к общей площади гепатоцитов;

б) отношение площади фиброзных поражений ткани к общей площади анализируемой ткани.

5.3.2. Требования к применяемому программному обеспечению

Выбор программного обеспечения определяется возможностью его эффективного использования для анализа микрофотографий, документирующих результаты исследования, с применением морфометрических методов. В частности, может быть рекомендована платформа ImageJ (Национальный институт здравоохранения США), которая обладает достаточно мощными полуавтоматическими инструментами для оценки необходимых показателей сравнения. Кроме этого, эта программа является общедоступной. При разработке в ее основу был положен принцип открытой архитектуры, благодаря чему возможности программы постоянно расширяются за счет свободно распространяемых плагинов.

5.3.3. Статистическая обработка результатов измерений

Статистический анализ данных проводят с помощью программного пакета Statistica 6.0 или аналогичного. Предварительную оценку характера распределения данных осуществляют с помощью теста Shapiro-Wilk. В соответствии с полученным результатом, при дальнейшей обработке применяют непараметрические критерии или критерии для нормально распределенных данных. Достоверность различий средних значений нескольких групп данных оценивают по критерию Friedman. При проведении обобщенной оценки достоверность различия средних значений для нескольких групп данных определяют по критерию Kruskal-Wallis, а для 2-х групп данных - по критерию Mann-Whitney. Для анализа различий между двумя группами связанных данных применяют парный t-критерий Student или непараметрический критерий Wilcoxon. Корреляционный анализ проводят с использованием статистики Spearman. Выводы считают достоверными при допустимой вероятности ошибки менее 0,05. Данные представляют в виде среднего арифметического +/- стандартное отклонение (SD).

5.4. Структура отчета об оценке действия наноматериалов

на организм животных по морфологическим признакам

а) Название эксперимента.

б) Поставленная задача эксперимента и его схема.

в) Характеристика лабораторных животных (вид, линия, пол, возраст, количество).

г) Протокол введения частиц и "плацебо".

д) Протокол вскрытия животного и забора органов, включающий данные по массе всех органов, а также полную информацию по макроскопически регистрируемым патологическим изменениям в ткани органов.

е) Протокол исследования тканей внутренних органов на светооптическом уровне с подробным описанием состояния ткани согласно п. 5.2.2.

ё) Результаты морфометрического исследования тканей животных.

ж) Результаты статистической обработки количественных данных.

д) Заключение.

VI. Критерии оценки действия наноматериалов на лабораторных

животных по метаболическим параметрам

6.1. При оценке действия наноматериалов на лабораторных животных по метаболическим параметрам в пробах биологического материала, полученного от лабораторных животных, подвергнутых воздействию наноматериалов, осуществляют анализ показателей, характеризующих состояние:

- белкового обмена;

- углеводного обмена;

- липидного обмена;

- водно-солевого обмена;

- минерального обмена;

- обмена витаминов;

- системы антиоксидантной защиты;

- системы детоксикации ксенобиотиков.

6.2. При составлении плана (дизайна) эксперимента по оценке действия наночастиц и наноматериалов на показатели метаболизма, необходимо обращать внимание на следующие факторы:

а) Методы, применяемые при забое животных (включая тип используемой анестезии), отборе и хранении до анализа биологических образцов, не должны приводить к неконтролируемым изменениям биохимических показателей.

б) Количества отбираемых биологических образцов должны быть достаточными для проведения всех необходимых анализов с учетом необходимого числа повторностей анализируемых пробы (обычно, не менее двух). Ввиду этого, в зависимости от числа анализов, массы тела и возраста животных численность экспериментальных групп животных может быть изменена в сторону увеличения.

6.3. Отбор проб биологического материала от лабораторных животных должен осуществляться в соответствии со стандартными методиками, утвержденными в установленном порядке (МУ 1.2.2745-10).

6.4. Составление плана эксперимента по оценке действия наночастиц и наноматериалов на показатели метаболизма производится с учетом имеющихся данных литературы об органах и системах, являющихся мишенями воздействия наноматериалов. При этом необходимо руководствоваться требованиями, изложенными в МУ 1.2.2520-09 (разделы 5, 6).

6.5. Оценка действия наноматериалов на показатели белкового обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

┌────────────────────────┬────────────────┬──────────────────────┬────────┐

│       Показатель       │  Исследуемый   │        Метод         │Литера- │

│                        │  биосубстрат   │                      │турный  │

│                        │                │                      │источник│

│                        │                │                      │<1>     │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Общий белок             │Сыворотка крови │Унифицированный метод │1, 25   │

│                        │                │по биуретовой реакции │        │

│                        │Моча            │Биуретовый метод      │1, 25   │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Альбумин                │Сыворотка крови │Унифицированный метод │1, 25   │

│                        │                │по реакции с          │        │

│                        │                │бромкрезоловым зеленым│        │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Белковые фракции        │Сыворотка крови │Унифицированный метод │1, 25   │

│                        │                │электофоретического   │        │

│                        │                │разделения            │        │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Креатинин               │Моча, сыворотка │Унифицированный метод │1, 2, 25│

│                        │крови (после    │по цветной реакции    │        │

│                        │депротеинизации)│Яффе с пикриновой     │        │

│                        │                │кислотой              │        │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Мочевина                │Сыворотка крови │Унифицированный метод │1, 2, 25│

│                        │                │по цветной реакции    │        │

│                        │                │с диацетилмонооксимом │        │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Мочевая кислота         │Сыворотка крови │Спектрофотометрический│1, 2, 25│

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Активность ферментов:   │                │                      │        │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Аланинаминотрансфераза  │Сыворотка крови │Спектрофотометрический│1, 2    │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Аспартатаминотрансфераза│Сыворотка крови │Спектрофотометрический│1, 2    │

├────────────────────────┼────────────────┼──────────────────────┼────────┤

│Щелочная фосфатаза      │Сыворотка крови │Спектрофотометрический│1, 2    │

└────────────────────────┴────────────────┴──────────────────────┴────────┘

--------------------------------

<1> См. Приложение 1.

6.6. Оценка действия наноматериалов на показатели углеводного обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

6.7. Оценка действия наноматериалов на показатели липидного обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

6.8. Оценка действия наноматериалов на показатели минерального обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

6.9. Оценка действия наноматериалов на показатели обмена витаминов осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

┌──────────────────────────┬───────────┬─────────────────────────┬────────┐

│        Показатель        │Исследуемый│          Метод          │Литера- │

│                          │биосубстрат│                         │турный  │

│                          │           │                         │источник│

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Витамин A                 │Сыворотка  │Спектрофотометрический,  │28      │

│                          │крови      │ВЭЖХ                     │        │

│                          │Печень     │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Витамин E                 │Сыворотка  │Спектрофлуориметрический,│28      │

│                          │крови      │ВЭЖХ                     │        │

│                          │Эритроциты │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Витамин C                 │Плазма     │Титрометрический         │28      │

│                          │крови      │                         │        │

│                          │Моча       │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Витамин B  (тиамин)       │Моча       │Спектрофлуориметрический │28      │

│         1                │           │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Транскетолаза эритроцитов │Эритроциты │Спектрофотометрический   │28      │

│и ГДФ-эффект              │           │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Витамин B                 │Моча       │Спектрофлуориметрический │28      │

│         2                │           │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Глутатионредуктаза        │Эритроциты │Спектрофотометрический   │28      │

│эритроцитов и ФАД-эффект  │           │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│4-пиридоксиновая кислота  │Моча       │Спектрофлуориметрический │28      │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Аспартатаминотрансфераза  │Эритроциты │Спектрофотометрический   │28      │

│эритроцитов и ПАЛФ-эффект │           │                         │        │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│N'-метилникотинамид       │Моча       │Спектрофлуориметрический │28      │

├──────────────────────────┼───────────┼─────────────────────────┼────────┤

│Никотинамидные коферменты │Кровь      │Спектрофлуориметрический │28      │

│(НАД и НАДФ)              │           │                         │        │

└──────────────────────────┴───────────┴─────────────────────────┴────────┘

Внимание! Крысы относятся к витамин C-синтезирующим животным!

6.10. Оценка действия наноматериалов на параметры системы антиоксидантной защиты осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

6.11. Оценка действия наноматериалов на ферментную систему метаболизма ксенобиотиков осуществляется путем анализа следующих показателей:

6.12. Оценка действия наноматериалов на стабильность биологических мембран осуществляется путем анализа следующих показателей:

6.13. Статистическая обработка результатов биохимических определений производится по единому плану, включающему следующие стадии:

1) Описательная статистика с определением числа значимых значений (N), выборочного среднего (M), стандартного отклонения (SD), стандартной ошибки среднего (m), медианы (мю).

2) Тест на однородность распределения исследуемого показателя в исследуемых группах с помощью теста на остаточную дисперсию (ANOVA).

3) Определение достоверности различия средних значений между группами с использованием двустороннего t-теста Стьюдента для несвязанных показателей. При расчете величины t-критерия вносят поправку на различие величины дисперсий сравниваемых групп, оцененную в тесте F на остаточную дисперсию.

4) Тест на однородность распределения исследуемого показателя в группах 1-7 с помощью непараметрического рангового критерия Красколла-Уоллеса.

5) Определение достоверности различия распределения в сравниваемых группах с помощью непараметрического рангового критерия Мана-Уитни.

6) Факторный анализ. Проверка однородности распределения тестируемого показателя в изучаемых группах по факторам: а) наличия носителя наночастиц, б) наличия наночастиц (группы 1, 4-7 против групп 2, 3), в) химического состава вводимых препаратов с помощью теста на остаточную дисперсию (ANOVA).

При проведении анализа по п. п. 3 и 5 сравнивают попарно: а) группу интактных животных контроль со всеми опытными группами; б) группы, получающие наночастицы, с группами, получающими носитель в эквивалентных дозах; в) группы, получавшие препараты наночастиц, с группами, получавшими традиционный химический аналог наноматериала.

Различия принимают за достоверные при вероятности принятия нуль-гипотезы (уровне значимости) P < 0,05.

Статистическую обработку проводят с использованием лицензионного профессионального программного обеспечения (Statistica, версия 6; SPSS, версия 17 и другие).

6.14. В качестве критериев наличия воздействия наноматериалов на метаболические параметры организма животного используют:

достоверные различия в уровнях определяемых метаболических параметрах между группами животных, получавших наноматериалы, и контрольными группами, получавшими в эквивалентных количествах носитель, применяемый при введении наноматериала;

наличие монотонной зависимости "доза-эффект" между количеством вводимого наноматериала и величиной ответа метаболического параметра.

6.15. В качестве критериев специфичности воздействия наноматериалов на метаболические параметры организма животного используют достоверные различия между группами животных, получавших наноматериалы, и контрольными группами, получавшими в эквивалентных количествах традиционный аналог наноматериала, вводимый на том же самом носителе.

Приложение 1

СПИСОК

РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПО МЕТОДАМ ОЦЕНКИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ

ПАРАМЕТРОВ ОРГАНИЗМА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

1. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/Под ред. Меньшикова В.В. М.: Медицина, 1987. 368 с.

2. Биохимические методы исследования в клинике/Под ред. Покровского А.А. М.: Медицина, 1969. 652 с.

3. ГОСТ 30178-96 "Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов".

4. Тиц Н. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. М.: Лабинформ, 1997. 960 с.

5. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А.//Вопросы мед. химии. 1994. N 2. С. 59-61.

6. Mills G.C.//J. Biol. Chem., 1959. V. 234. N 3. P. 502-506.

7. Oshino N., Chance B., Sies H., Bucher T.//Arch. Biochem. Biophys., 1973. V. 154. P. 117-131.

8. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В.//Вопросы мед. химии, 1994. N 2. С. 56-58.

9. Niashikimi M., Rao N.A., Jagi K.//Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972. V. 46. P. 849-854.

10. Иргашев Ш.Б., Юлдашев Н.М., Гурнев С.Б., Хадиметова Ш.А., Эльмуратова М.Т. Процессы гидроксилирования и интенсивность ПОЛ в микросомах печени при экспериментальном инфаркте миокарда//Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1993. N 3. С. 19-20.

11. Ernster L., Nordenbrandt K.//Meth. Enzymology. 1967. V. 10. P. 575.

12. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И.//Лаб. дело. 1983. V. 3. С. 33-35.

13. Placer Z.//Nahrung. 1968. V. 12. P. 679.

14. Tilbotsen J.A., Sauberlich H.S.//J. Nutr. 1971. T. 101. P. 1459.

15. Пестова М.И., Гмошинский И.В., Мазо В.К. Влияние потребления молока на активность системы детоксикации формальдегида при сенсибилизации этим соединением//Вопросы питания. 1992. N 5-6. С. 41-44.

16. Omura T., Sato R.//Biol. Chem. 1964. N 239. P. 2370-2378.

17. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S., et al.//Drag Metabolism and Disposition. 1999. Vol. 27. P. 1381-1391.

18. Burke M.D., Mayer R.T. //Chem.-Biol. Interact, 1983. Vol. 45. P. 243-258.

19. Umegaki K., Saito K., Kubota Y., et al.//Jpn. J. Pharmacol. 2002. V. 90, N 4. P. 345-351.

20. Habig W.H., Pabst W.J., Jacoby W.B.//J. Biol. Chem. 1974. Vol. 294. P. 7130-7139.

21. Burchell B., Weatherill P.//Methods Enzimol. 1981. Vol. 77. P. 169-177.

22. Benson A.M., Hunkeler M.J., Talalay P.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77, N 9. P. 5216-5220.

23. Дингл Д. Лизосомы. Методы исследования. М., 1980. 344 с.

24. Assman G., Schreiwer H., Schmitz G., et al.//Clin. Chem. 1983. Vol. 29. P. 2026-2030.

25. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск: "Беларусь", 2009 (т. 1-495 с; т. 2-463 с.).

26. Preparation of fatty acid methyl esters/IUPAC 2.301 Standard methods for the analysis of oils, fats and derivates, Pergamon Press, 1979.

27. Gas-liquid chromatography of fatty acid methyl esters/IUPAC 2.302 Standard methods for the analysis of oils, fats and derivates, Pergamon Press, 1979.

28. Теоретические и клинические аспекты науки о питании. Т. VIII. Методы оценки обеспеченности населения витаминами/Под ред. Волгарева М.Н. М., 1987, 217 с.

Приложение 2

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

СОП - Стандартные операционные процедуры

МУ - Методические указания

МУК - Методические указания по методам контроля

МР - Методические рекомендации

СП - Санитарные правила

ЖКТ - Желудочно-кишечный тракт

ЦНС - Центральная нервная система

ПАВ - Поверхностно-активные вещества

ГКИТ - Гигантские клетки инородных тел