8.4.4. Градуировочные растворы центрифугируют со скоростью 2000 об./мин. в течение 10 мин., отбирают 0,5 куб. см плазмы в стаканчик СВ 19/9 и проводят твердофазную экстракцию. Для этого в каждый стаканчик с плазмой добавляют 1 куб. см дистиллированной воды, 6 куб. мм 4%-го раствора о-фосфорной кислоты, перемешивают и пропускают под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 1cc, который предварительно промывают 1 куб. см ацетонитрила и 1 куб. см дистиллированной воды. Затем картридж с пропущенной через него пробой промывают 1 куб. см дистиллированной воды и 1 куб. см 20%-го раствора ацетонитрила. Затем переносят патрон с сорбентом в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 0,5 куб. см ацетонитрила. Скорость потока во время экстракции не должна превышать 1 куб. см/мин. Полученный экстракт фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц "Луер", в стеклянную виалу и аликвотную часть (10 куб. мм) анализируют на приборе.

8.4.5. Условия хроматографирования:

    колонка 2,1 х 150 мм, заполненная сорбентом Eclipse XDB-C  ;

                                                             18

подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды в соотношении 25:75;

градиент: 10 мин. подача подвижной фазы (25% ацетонитрила и 75% воды), увеличение ацетонитрила с 25 до 90% в течение 5 мин., 5 мин. подача 90% ацетонитрила, снижение ацетонитрила до 25% в течение 5 мин., подача 25% ацетонитрила до уравновешивания колонки (10 мин.);

    скорость движения элюента                    1,0 куб. см/мин.;

    температура термостата колонки               27 °С;

    флуориметрический детектор:

    длина волны возбуждения                      246 нм

    длина волны эмиссии                          330 нм

    время удерживания диметилтерефталата:        8,6 +/- 0,1 мин.

8.4.6. Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

                                  n

                                 SUM C  / S

                                 i=1  i    i

                             К = -----------,

                                      n

    где:

    C    -   массовая   концентрация  диметилтерефталата  в  градуировочном

     i

растворе, мкг/куб. см;

    S   -  среднее  значение трех измерений площади пика диметилтерефталата

     i

i-й концентрации, расхождение между минимальным и максимальным значением из

которых  не  должно  превышать 4% относительно среднего значения S  единицы

                                                                  i

оптической плотности (е.о.п.);

    n - количество градуировочных смесей (n = 6).

8.4.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация диметилтерефталата соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

|Х - C| <= 0,10 х C,

где:

C - заданная массовая концентрация диметилтерефталата в градуировочном растворе;

Х - результат измерения массовой концентрации диметилтерефталата в градуировочном растворе.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

8.5. Отбор проб

Отбирают венозную кровь объемом не менее 4 куб. см в мерную стеклянную пробирку с 0,05 куб. см гепарина. Срок хранения проб в холодильнике 6 ч.

9. Выполнение измерений

Выполняют два параллельных измерения образца крови. Центрифугируют 1 куб. см крови со скоростью 2000 об./мин. в течение 5 - 10 мин. Отбирают 0,5 куб. см плазмы в стаканчик СВ 19/9, добавляют 1 куб. см дистиллированной воды, 6 куб. мм 4%-го раствора о-фосфорной кислоты и проводят твердофазную экстракцию, последовательно пропуская под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 1cc 1 куб. см ацетонитрила, 1 куб. см дистиллированной воды, 1,5 куб. см раствора плазмы, 1 куб. см дистиллированной воды, 1 куб. см 20%-го водного раствора ацетонитрила. Затем переносят патрон с сорбентом в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 0,5 куб. см ацетонитрила. Скорость потока во время экстракции не должна превышать 1 куб. см/мин. Полученный экстракт фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц, в стеклянную виалу и аликвотную часть (10 куб. мм) анализируют в условиях, указанных в п. 8.4.5.

Идентификацию диметилтерефталата проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и стандартном растворе.

10. Обработка (вычисление) результатов измерений

10.1. Массовую концентрацию диметилтерефталата в крови (мкг/куб. см) вычисляют по формуле:

                                Х = S  х К,

                                     i

    где:

    Х  -  массовая  концентрация  диметилтерефталата в анализируемой пробе,

мкг/куб. см;

    S  - площадь пика диметилтерефталата на хроматограмме, е.о.п.;

     i

    К - градуировочный коэффициент.

                                      _

    10.2.   За  результат  измерения  Х  принимают  среднее  арифметическое

значение  двух  результатов  измерений, полученных в условиях повторяемости

Х , Х  (параллельных определений), для которых выполняется условие:

 1   2

                                             Х  + Х

                                              1    2

                     |Х  - Х | <= 0,01 х r х -------,                   (1)

                       1    2                   2

    где  r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены

в табл. 3.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

                                                Х  + Х  + Х  + Х

                                                 1    2    3    4

        |Х      - Х     | <= 0,01 х CR    (4) х -----------------,      (2)

          max.4    min.4              0,95              4

    где CR    (4) - критический диапазон. Значения  критического  диапазона

          0,95

приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:

                                             _    _

                                             Х  + Х

                      _    _                  1    2

                     |Х  - Х | <= 0,01 х R х -------,                   (3)

                       1    2                   2

         _        _

    где  Х    и   Х    -   результаты   измерений   массовой   концентрации

          1        2

диметилтерефталата,    полученные   в   разных   лабораториях,  -   средние

арифметические   двух   результатов   измерений,   полученных   в  условиях

повторяемости, для которых выполняется условие (1).

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

Таблица 3

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

И КРИТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ

P = 0,95

┌──────────┬───────────────────┬────────────────────────┬─────────────────┐

│ Диапазон │Предел повторяемо- │  Критический диапазон  │Предел воспроиз- │

│измерений,│сти (относительное │ (относительное значение│водимости (отно- │

│   мкг/   │значение допускае- │допускаемого расхождения│сительное значе- │

│ куб. см  │мого расхождения   │   между наибольшим и   │ние допускаемого │

│          │между двумя резуль-│   наименьшим четырех   │расхождения меж- │

│          │татами измерений,  │ результатов измерений, │ду двумя резуль- │

│          │полученными в одной│   полученных в одной   │татами измерений,│

│          │лаборатории в усло-│ лаборатории в условиях │полученными в    │

│          │виях повторяемо-   │     повторяемости),    │разных лабора-   │

│          │сти), r, %         │       CR    (4); %     │ториях), R, %    │

│          │                   │         0,95           │                 │

├──────────┼───────────────────┼────────────────────────┼─────────────────┤

│от 0,02 до│17                 │22                      │34               │

│1 включ.  │                   │                        │                 │

└──────────┴───────────────────┴────────────────────────┴─────────────────┘

11. Оформление результатов измерений

Результат измерений в документах, предусматривающих его использование, может быть представлен в виде:

                   _

                  (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см, P = 0,95,

    где ДЕЛЬТА -  характеристика  погрешности,  мкг/куб. см, при  P = 0,95,

значение ДЕЛЬТА рассчитывают по формуле:

                                             _

                                    дельта х Х

                           ДЕЛЬТА = ----------.

                                       100

Значение дельта приведено в табл. 1.

12. Процедуры обеспечения достоверности измерений

Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6 и РМГ 76.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

12.1. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений

с использованием метода добавок

    Оперативный   контроль  процедуры  измерений  с  использованием  метода

добавок  проводят  путем  сравнения  результата отдельно взятой контрольной

процедуры К  с нормативом контроля К.

           к

    Результат контрольной процедуры К  рассчитывают по формуле:

                                     к

                                  _    _

                            К  = |Х' - Х - C |,

                             к              д

    где:

    _

    Х'  -  результат  измерений массовой концентрации  диметилтерефталата в

пробе  с  известной  добавкой  -  среднее  арифметическое  двух результатов

измерений,  полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми

удовлетворяет условию (1);

    _

    Х  -  результат  измерений  массовой  концентрации диметилтерефталата в

исходной   пробе  -  среднее  арифметическое  двух  результатов  измерений,

полученных   в   условиях   повторяемости,   расхождение   между   которыми

удовлетворяет условию (1);

    C   -  величина  добавки  к пробе, мкг/куб. см. Величина добавки должна

     д

составлять не менее 40% от содержания диметилтерефталата в рабочей пробе.

    Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

                              _____________________

                             /     2            2

                       К = \/ДЕЛЬТА  _  + ДЕЛЬТА  _,

                                   л,Х'         л,Х

    где:

    ДЕЛЬТА  _ , ДЕЛЬТА  _   -     значения    характеристики    погрешности

          л,Х'        л,Х

результатов  измерений, установленные в лаборатории при реализации методики

измерений, соответствующие массовой концентрации диметилтерефталата в пробе

с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

    Примечание.  Допустимо характеристику погрешности результатов измерений

при  внедрении  методики  измерений  в  лаборатории устанавливать на основе

выражения:  ДЕЛЬТА   =  0,84  х  ДЕЛЬТА,  с  последующим уточнением по мере

                  л

накопления   информации   в   процессе  контроля  стабильности  результатов

измерений.

    Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

                                 К  <= К.                               (4)

                                  к

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.2. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле

внутрилабораторной прецизионности

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб крови.

    При   реализации   контрольной   процедуры   получают   два  результата

                                  _               _

контрольных измерений (первичного Х  и повторного Х ) массовой концентрации

                                   1               2

диметилтерефталата в условиях внутрилабораторной прецизионности.

    Результат   контрольной   процедуры   признают  удовлетворительным  при

выполнении следующего условия:

                                              _    _

                                              Х  + Х

                                               1    2

                     |Х  - Х | <= 0,01 х R  х -------.                  (5)

                       1    2             л      2

    Значение предела внутрилабораторной прецизионности (R , %) не превышает

                                                         л

28%.

13. Разработчики

"Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора.