"МУК 4.2.2878-11. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2321-08. Методические указания" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

24 июня 2011 года

Дата введения:

с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ 1 К МУК 4.2.2321-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2878-11

1. Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" при участии фирмы "BioMerieux".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24.06.2011.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2321-08:

1. Раздел 1 "Общие положения и область применения" дополнить абзацем 1.3 следующего содержания:

"1.3. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C. jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ кампилобактериозной природы у человека)".

2. Раздел 2 "Сущность метода" изложить в новой редакции:

"2. Сущность методов

2.1. Бактериологический метод определения бактерий рода Campylobacter основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к видам бактерий рода Campylobacter.

2.2. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, меченных щелочной фосфатазой, и флюоресцентно-меченого субстрата и измерении флюоресценции продукта гидролиза флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой. Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм.

2.2.1. Для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм, и тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами наконечники, используемые в качестве пипетирующего устройства, и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа, зарегистрированные в РФ в установленном порядке. Предел обнаружения бактерий рода Campylobacter при использовании данного метода соответствует 1 клетке на 25 г (при наличии предобогащения).

2.2.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют анализаторы иммуноферментные и тест-наборы, зарегистрированные в РФ в установленном порядке и обеспечивающие проведение измерений с характеристиками специфичности и чувствительности, указанными в п. п. 1.3 и 2.2.1".

3. В разделе 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" пункт 3.1 "Аппаратура и инструментарий" дополнить строкой:

Автоматический ИФА-анализатор для

фермент-связанного флюоресцентного

иммуноанализа типа VIDAS(R) или

miniVIDAS(R), или с аналогичными

характеристиками, подобный BioMerieux,

Франция, или аналог.

4. В разделе 3 пункт 3.2 "Лабораторная посуда и материалы" дополнить строками:

Пакет для гомогенизации с фильтром, подобный

BioMerieux, Франция, или аналог

Набор реагентов для определения бактерий рода

Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM)

или с аналогичными характеристиками, подобный

BioMerieux, Франция, или аналог.

5. Раздел 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" дополнить пунктом 3.5 в следующей редакции:

"3.5. Состав тест-набора для фермент-связанного

флюоресцентного иммуноанализа

В состав тест-набора входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов, состоящий из следующих компонентов:

3.5.1. Состав стрипа для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Каждый стрип в тест-наборе состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа. Распределение лунок в стрипе:

3.5.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа допускается использование другого оборудования и тест-наборов аналогичного назначения, зарегистрированных в РФ в установленном порядке, с аналогичными характеристиками чувствительности и специфичности".

6. Раздел 4 "Подготовка к анализу" дополнить пунктом 4.3 в следующей редакции:

"4.3. Требования к выполнению фермент-связанного

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:

- не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

- не использовать набор по истечении срока годности;

- не смешивать реактивы из различных партий;

- пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;

- анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

Тест-набор содержит едкий реактив диэтаноламин, а также натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления.

4.3.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

7. Раздел 7 дополнить пунктом 7.3 в следующей редакции:

- Перед использованием реактивов новой партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов, используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов.

- Для каждой новой партии реактивов проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора. Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14 дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и наконечники в анализатор и запустить программу.

Эта операция необходима для построения точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку.

7.3.2. Подготовка образцов к фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу

Отобрать в пробирку 1 - 2 куб. см бульона обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 - 100 °С. Охладить 10 мин., перемешать и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора.

Оставшуюся часть бульона хранят в холодильнике при 2 - 4 °С для подтверждения положительных образцов.

7.3.3. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин.

Для каждого анализа используется 1 стрип и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин.

Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]

Результат теста со значением меньше порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести подтверждение положительного результата по п. 7.3.5.

Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту.

На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация.

7.3.5. Подтверждение положительного результата

Подтверждение положительного результата проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения, полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п. 4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) °С в течение 20 - 24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч.

При наличии характерных колоний необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1.

При получении противоречивых результатов (положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы".

30 стрипов для определения бактерий рода Campylobacter	STR	Готовы к использованию
30 наконечников	SPR	Готовы к использованию. На внутреннюю поверхность наконечников нанесены антитела к поверхностным антигенам Campylobacter
Стандарт (1 фл. по 6 мл)	S1	Готов к использованию. Очищенный и инактиви- рованный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте
Положительный контроль определения (1 фл. по 6 мл)	C1	Готов к использованию. Очищенный и инактиви- рованный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте
Отрицательный контроль определения (1 фл. по 6 мл)	C2	Готов к использованию. Забуференный физиологический раствор - твин + консервант. Максимальное приемлемое значение указано на калибровочной карте
1 калибровочная карта		Лист спецификаций с фабричными установками для калибровки тестов
1 инструкция

Лунка	Реактивы
1	Лунка для внесения образца: внесите 0,5 куб. см бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта или контроля
2	Предпромывочный буфер (400 куб. мм): забуференный физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант
3 - 4 - 5 - 7 - 8 - 9	Промывочный буфер (600 куб. мм): забуференный физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант
6	Конъюгат (400 куб. мм): антитела (IgG) к Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой + консервант
10	Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм): 4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин (0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант

Результат теста	Интерпретация
< 0,1	Отрицательный
>= 0,1	Положительный