2. Приписанные характеристики погрешности измерений

Методика обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значения, приведенного в табл. 2.

Таблица 2

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЯ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,

ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВНУТРИЛАБОРАТОРНОЙ ПРЕЦИЗИОННОСТИ,

ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

┌───────────┬─────────────┬────────────────┬────────────────┬─────────────┐

│ Диапазон  │Показатель   │Показатель вну- │Показатель во-  │ Показатель  │

│измерений, │повторяемости│трилабораторной │спроизводимости │точности <*> │

│мкг/куб. см│(относитель- │прецизионности  │(относительное  │  (границы   │

│           │ное значение │(относительное  │значение средне-│относительной│

│           │среднеквадра-│значение средне-│квадратического │ погрешности │

│           │тического от-│квадратического │отклонения вос- │     при     │

│           │клонения пов-│отклонения вну- │производимости),│ вероятности │

│           │торяемости), │трилабораторной │сигма , %       │ P = 0,95),  │

│           │сигма , %    │прецизионности),│     R          │+/- дельта, %│

│           │     r       │сигма  , %      │                │             │

│           │             │     Rл         │                │             │

├───────────┼─────────────┼────────────────┼────────────────┼─────────────┤

│от 1 до    │6            │9               │11,5            │23           │

│20 включ.  │             │                │                │             │

├───────────┴─────────────┴────────────────┴────────────────┴─────────────┤

│    <*> Соответствует    относительной    расширенной    неопределенности│

│измерений при коэффициенте охвата 2                                      │

└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

3. Сущность метода

Методика основана на выделении фталевой кислоты из крови методом твердофазной экстракции на полимерном сорбенте Oasis HLB и количественном определении экстракта на жидкостном хроматографе с использованием УФ-детектора.

Определению не мешают уксусная кислота, малеиновая, бензойная и другие бензолкарбоновые кислоты.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства,

материалы, растворы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

4.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым

(УФ) детектором

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические            ГОСТ 24104-01

Гири Г -210                                        ГОСТ 7328-01

      2

pH-метр-милливольтметр pH-150 М                    ГОСТ 22261-94

Колбы мерные вместимостью 50, 100 куб. см

Пробирки мерные вместимостью 10 куб. см            ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные вместимостью

1, 5, 10 куб. см                                   ГОСТ 29227-91

Пипетка градуированная вместимостью 0,1 куб. см    ГОСТ 20292-74

Редуктор кислородный                               ТУ 26-05-236-73

4.2. Вспомогательные устройства

Колонка металлическая 80 x 2 мм, заполненная

сорбентом Диасорб С

                   16

Предколонка металлическая 12 x 1,5 мм,

заполненная сорбентом Диасорб С

                               16

Картриджи с сорбентом Oasis HLB lcc ("Waters")

Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон"                    ТУ 9443-001-245.23530-97

Установка для твердофазной экстракции

(Waters), включающая держатель для

картриджей (манифолд) и вакуумный насос

(600 мм рт. ст.)

Дистиллятор                                        ТУ 61-1-721-79

Сушильный шкаф ШСС-80                              ТУ 16.531.743-83

Воронка Шотта (пор 16)                             ГОСТ 25336-82

Бюксы СВ 19/9                                      ТУ 92-891.029-91

Пробирки центрифужные пропиленовые

с завинчивающейся крышкой, пр-во "Sarstedt"

Германия

4.3. Реактивы

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ос.ч.    ТУ 6-09-14-2167-84

Вода дистиллированная                              ГОСТ 6709-72

Метанол                                            ТУ 6-09-2192-85

Спирт этиловый, ректификованный,

из пищевого сырья                                  ГОСТ Р 51652-2000

о-Фосфорная кислота, ос.ч.                         ТУ 2612-014-00203677-97

Фталевая кислота, ч.д.а.                           ГОСТ 4556-78

Раствор гепарина в ампулах

(5000 ед. в 1 куб. см)

4.4. Материалы

Гелий газообразный                                 ТУ 51-940-80

4.5. Растворы

0,36%-ный раствор фосфорной кислоты

Раствор фосфорной кислоты с pH = 3,0

Элюент для хроматографии

5%-ный раствор метанола

Исходный раствор фталевой кислоты

для градуировки (раствор А)

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химических реактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

5. Требования безопасности

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности по ГОСТ 12.1.007-76 [3] и ГОСТ 12.1.005-88 [4].

5.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации прибора", правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 [5], противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 [6] и имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 [7].

5.3. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 от 01.05.2008 [8].

5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в Руководстве по правилам эксплуатации жидкостного хроматографа.

6. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности анализа.

7. Условия измерений

7.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15 - 25 °C;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °C.

7.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией прибора.

8. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

8.1. Подготовка посуды

Используемую посуду вымыть мыльным раствором, промыть проточной водопроводной водой, обработать этиловым спиртом, ополоснуть дистиллированной водой и высушить при температуре 120 °C.

8.2. Приготовление растворов

8.2.1. 0,36%-ный раствор фосфорной кислоты. В мерную колбу объемом 50 куб. см вносят 0,1 куб. см концентрированной о-фосфорной кислоты (плотность 1,78 г/куб. см), доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения раствора - 30 дней в стеклянной таре с притертой пробкой в комнатных условиях.

8.2.2. Раствор фосфорной кислоты с pH = 3,0. Готовят постепенным добавлением 3,6 - 3,8 куб. см 0,36%-ного раствора фосфорной кислоты к 100 куб. см дистиллированной воды, проверяя кислотность раствора на pH-метре.

8.2.3. Элюент для хроматографии. Смешивают раствор фосфорной кислоты (pH = 3) с ацетонитрилом в объемном отношении 85:15, смесь фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3 - 5 мин. со скоростью 50 - 60 куб. см/мин. Срок хранения приготовленного элюента 5 дней при комнатной температуре в стеклянной посуде с притертой пробкой.

8.2.4. 5%-ный раствор метанола (объемные единицы). 5,0 куб. см метанола вносят в мерную колбу объемом 100 куб. см, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения раствора - 30 дней в стеклянной таре с притертой пробкой в комнатных условиях.

8.2.5. Исходный раствор фталевой кислоты для градуировки (раствор А). 10,0 мг фталевой кислоты вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 2,0 куб. см этанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения кристаллов фталевой кислоты и доводят дистиллированной водой до метки. Концентрация исходного раствора фталевой кислоты составляет 0,1 мг/куб. см. Используют свежеприготовленный раствор.

8.3. Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент, приготовленный в соответствии с п. 8.2.3, со скоростью 100 куб. мм/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

8.4. Установление градуировочной характеристики

8.4.1. Градуировочную характеристику устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят из исходного раствора для градуировки (раствор А), приготовленного по п. 8.2.5.

8.4.2. Градуировочные смеси готовят из свежеотобранной крови. Собирается суммарная проба крови объемом не менее 100 куб. см с добавлением 0,5 куб. см гепарина. В соответствии с п. 9 проводят анализ пробы крови на содержание о-фталевой кислоты. При наличии о-фталевой кислоты в холостой пробе вычитают ее фоновое содержание при построении градуировки.

8.4.3. Градуировочные растворы готовят в мерных пробирках вместимостью 10,0 куб. см. Для этого в каждую пробирку вносят раствор А в соответствии с табл. 3, доводят объем до 5 куб. см цельной кровью и перемешивают. Анализируют свежеприготовленные растворы.

Таблица 3

РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ ФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИ

5,0 куб. см каждого градуировочного раствора переносят в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют со скоростью 2000 об./мин. в течение 5 мин. Отбирают 2,0 куб. см плазмы, подкисляют 20 куб. мм концентрированной фосфорной кислоты и проводят твердофазную экстракцию на установке, состоящей из держателя для картриджей (манифолда) и вакуумного насоса (производства фирмы Waters). После закрепления картриджа на манифолде и установлении разряжения в камере манифолда 5 - 10 мм рт. ст. с помощью встроенного манометра и регулировочного винта, последовательно пропускают через картридж с сорбентом Oasis lcc 1 куб. см метанола, 1 куб. см дистиллированной воды, 2 куб. см плазмы и 1 куб. см 5%-ного раствора метанола, скорость потока не должна превышать 1 куб. см/мин. Затем переносят патрон с сорбентом в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 1,0 куб. см метанола. Экстракт высушивают в потоке воздуха досуха, осадок повторно растворяют в 0,2 куб. см метанола. Аликвотную часть полученного экстракта (10 куб. мм) анализируют в условиях:

    элюент - раствор, приготовленный по п. 8.2.3;

    колонка  80 x 2 мм, заполненная Диасорбом С   и защищенная предколонкой

                                               16

12 x 1,5 мм с сорбентом Диасорб С  ;

                                 16

    скорость движения элюента                            100 куб. мм/мин.;

    длина волны УФ-детектора                             200 нм;

    ориентировочное время входа фталевой кислоты:        4,20 +/- 0,21 мин.

    Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

                                  n

                                 SUM C  / S

                                 i=1  i    i

                             K = -----------,

                                      n

    где:

    C   -  массовая  концентрация  фталевой кислоты в градуировочной смеси,

     i

мкг/куб. см;

    S   - среднее значение трех измерений площади пика фталевой кислоты i-й

     i

концентрации,  расхождение  между  минимальным  и максимальным значением из

которых не должно превышать 5% относительно среднего значения S ;

                                                               i

    n - количество градуировочных смесей (n = 6).

8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация фталевой кислоты соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

|X - C| <= 0,08 x C,

где:

C - заданная концентрация фталевой кислоты в градуировочном растворе;

X - результат измерения массовой концентрации фталевой кислоты в градуировочном растворе.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

8.5. Отбор проб

Отбирают пробы венозной крови объемом не менее 8 куб. см в чистую пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,2 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике 6,0 часов.

9. Выполнение измерений

Выполняют два параллельных измерения образца крови. 4,0 куб. см крови переносят в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют со скоростью 2000 об./мин. в течение 5 мин. Отбирают 2,0 куб. см плазмы, добавляют 20 куб. мм концентрированной фосфорной кислоты и проводят твердофазную экстракцию: последовательно пропускают под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB lcc 1 куб. см метанола, 1 куб. см дистиллированной воды, 2 куб. см плазмы и 1 куб. см 5%-ного раствора метанола со скоростью потока не более 1 куб. см/мин. Затем переносят патрон с сорбентом в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 1,0 куб. см метанола. Экстракт высушивают в потоке воздуха досуха, осадок повторно растворяют в 0,2 куб. см метанола. Анализируют 10 куб. мм полученного раствора в условиях, указанных в п. 8.4.3.

Идентификацию хроматографического пика фталевой кислоты проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и градуировочном растворе.

10. Обработка (вычисление) результатов измерения

10.1. Массовую концентрацию фталевой кислоты в крови X (мкг/куб. см) вычисляют по формуле:

                                X = S  x K,

                                     i

    где:

    S  - площадь пика фталевой кислоты на хроматограмме, е.о.п.;

     i

    K - градуировочный коэффициент.

                                      _

    10.2.   За  результат  измерения  X  принимают  среднее  арифметическое

значение  двух  параллельных  определений  X ,  X , для которых выполняется

                                            1    2

условие:

                                              X  + X

                                               1    2

                      |X  - X | <= 0,01 x r x -------,                  (1)

                        1    2                   2

    где r - предел повторяемости.  Значения предела повторяемости приведены

в табл. 5.

Таблица 5

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

И КРИТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ

ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95

┌────────────┬────────────────────┬──────────────────────┬────────────────┐

│  Диапазон  │Предел повторяемости│Критический диапазон  │Предел воспроиз-│

│ измерений, │(относительное зна- │(относительное значе- │водимости (отно-│

│мкг/куб. см │чение допускаемого  │ние допускаемого рас- │сительное значе-│

│            │расхождения между   │хождения между наибо- │ние допускаемого│

│            │двумя результатами  │льшим и наименьшим че-│расхождения меж-│

│            │измерений, получен- │тырех результатов из- │ду двумя резуль-│

│            │ными в одной лабора-│мерений, полученных в │татами измере-  │

│            │тории в условиях по-│одной лаборатории в   │ний, полученными│

│            │вторяемости), r, %  │условиях повторяемо-  │в разных лабора-│

│            │                    │сти), CR    (4), %    │ториях), R, %   │

│            │                    │        0,95          │                │

├────────────┼────────────────────┼──────────────────────┼────────────────┤

│От 1        │17                  │25                    │32              │

│до 20 включ.│                    │                      │                │

└────────────┴────────────────────┴──────────────────────┴────────────────┘

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

                                               X  + X  + X  + X

                                                1    2    3    4

       |X      - X     | <= 0,01 x CR    (4) x -----------------,       (2)

         max,4    min,4              0,95              4

    где  CR    (4) - критический  диапазон. Значения критического диапазона

           0,95

приведены в табл. 5.

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений).

Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:

                                             _    _

                                             X  + X

                      _    _                  1    2

                     |X  - X | <= 0,01 x R x -------,                   (3)

                       1    2                   2

         _      _

    где  X   и  X   -  результаты  измерений массовой концентрации фталевой

          1      2

кислоты,  полученные  в разных  лабораториях, - средние арифметические двух

результатов  измерений,  полученных  в  условиях повторяемости, для которых

выполняется условие (1).

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 5.

При невыполнении условия (3) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

11. Оформление результатов измерений

                                              _

    Результат  измерения представляют в виде (X + ДЕЛЬТА), мкг/куб. см, где

ДЕЛЬТА  -  характеристика  погрешности, мкг/куб. см, при P = 0,95, значение

ДЕЛЬТА рассчитывают по формуле:

                                             _

                                    дельта x X

                           ДЕЛЬТА = ----------,

                                       100

    где значение дельта приведено в табл. 2.

12. Контроль стабильности результатов измерений

в пределах лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6 [9] и РМГ 76-2004 ГСИ [10].

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

13. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений

с использованием метода добавок

    Оперативный  контроль  процедуры  измерений  проводят  путем  сравнения

результата  отдельно  взятой контрольной процедуры K  с нормативом контроля

                                                    к

K.

    Результат контрольной процедуры K  рассчитывают по формуле:

                                     к

                                  _    _

                            K  = |X' - X - C |,

                             к              д

    где:

    _

    X' - результат измерений массовой концентрации фталевой кислоты в пробе

с  известной  добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений,

полученных   в   условиях   повторяемости,   расхождение   между   которыми

удовлетворяет условию (1);

    _

    X  -  результат  измерений  массовой  концентрации  фталевой  кислоты в

исходной   пробе  -  среднее  арифметическое  двух  результатов  измерений,

полученных   в   условиях   повторяемости,   расхождение   между   которыми

удовлетворяет условию (1).

    Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

                            _________________________

                           /     2              2

                     K = \/ДЕЛЬТА       + ДЕЛЬТА     ,

                                 л,X'           л,X

                                     ср            ср

               2              2

    где  ДЕЛЬТА      ,  ДЕЛЬТА       -  значения характеристики погрешности

               л,X'           л,X

                   ср            ср

результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики,

соответствующие  массовой концентрации фталевой кислоты в пробе с известной

добавкой и в исходной пробе соответственно.

    Примечание.  Допустимо характеристику погрешности результатов измерений

при  внедрении  методики  в  лаборатории устанавливать на основе выражения:

ДЕЛЬТА   =  0,84  x  ДЕЛЬТА,  с  последующим  уточнением по мере накопления

      л

информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

    Процедуру   измерений   признают   удовлетворительной   при  выполнении

условия:

                               K  <= K.                                 (4)

                                к

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле

внутрилабораторной прецизионности

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб крови.

    При   реализации   контрольной   процедуры   получают   два  результата

контрольных измерений (первичного X  и повторного X ) массовой концентрации

                                   1               2

фталевой кислоты в условиях внутрилабораторной прецизионности.

    Результат   контрольной   процедуры   признают  удовлетворительным  при

выполнении следующего условия:

                            |X  - X | <= R .                            (5)

                              1    2      л

Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 6.

Таблица 6

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛА ВНУТРИЛАБОРАТОРНОЙ ПРЕЦИЗИОННОСТИ

ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95

┌─────────────────┬───────────────────────────────────────────────────────┐

│    Диапазон     │Предел внутрилабораторной прецизионности (относительное│

│   измерений,    │     значение допускаемого расхождения между двумя     │

│   мкг/куб. см   │результатами измерений, полученными в одной лаборатории│

│                 │ в условиях внутрилабораторной прецизионности), R , %  │

│                 │                                                 л     │

├─────────────────┼───────────────────────────────────────────────────────┤

│от 1 до 20 включ.│25                                                     │

└─────────────────┴───────────────────────────────────────────────────────┘

Приложение

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Химическая энциклопедия/ Под ред. Горкина А.П. М.: Большая Рос. энциклопедия, 1988.

2. Лазарев Н.В. Справ.: Вредные вещества в промышленности. Органические вещества. Т. 2. М.: Химия, 1976.

3. ГОСТ 12.1.007-76 "ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

5. ГОСТ 12.1.019-79 "ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

6. ГОСТ 12.1.004-91 "ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования".

7. ГОСТ 12.4.009-83 "ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

8. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 от 01.05.2008 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

9. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

10. РМГ 76-2004 "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".