|
Градуировочный раствор |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Объем исходного
стандартного раствора, |
1 |
3 |
5 |
7 |
10 |
|
Концентрация
уксусной кислоты, |
1,560 |
4,680 |
7,800 |
10,920 |
15,600 |
|
Концентрация пропионовой кислоты, |
0,998 |
2,990 |
4,990 |
6,990 |
9,980 |
|
Концентрация
изомасляной кислоты, |
0,960 |
2,870 |
4,790 |
6,710 |
9,580 |
|
Концентрация
масляной кислоты, |
0,960 |
2,880 |
4,790 |
6,710 |
9,590 |
|
Концентрация
валериановой кислоты, |
0,470 |
1,390 |
2,330 |
3,260 |
4,650 |
|
Концентрация изокапроновой кислоты, |
0,460 |
1,390 |
2,310 |
3,230 |
4,620 |
|
Концентрация
капроновой кислоты, |
0,460 |
1,390 |
2,310 |
3,230 |
4,620 |
8.4.2. Приготовление рабочих растворов.
Для построения градуировочного графика используют
цельную кровь, не содержащую исследуемые компоненты. В пробирки со стандартными
смесями, приготовленными по п. 8.4.1, добавляют по 2 куб. см крови, подкисляют
0,5 куб. см 1%-ного раствора серной кислоты до pH 2 - 3 (pH среды контролируется
по индикаторной бумаге), экстрагируют 2 куб. см изобутилового спирта в течение
5 - 10 мин. Для отделения денатурированных белков экстракты центрифугируют при
6000 об./мин. в течение 10
мин., надосадочную жидкость переносят в бюкс. Прибавляют по 0,1 куб. см 0,4%-ного
раствора щелочи (pH среды контролируется по
индикаторной бумаге), растворы упаривают досуха при температуре 50 - 55 °C
(экстракты упариваются под ИК-лампой). Добавляют 0,05
куб. см 1%-ного раствора серной кислоты, 0,1 куб. см изобутанола, перемешивают.
8.4.3. Хроматографирование
растворов. В хроматографическую колонку через
испаритель вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного
раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок 70 - 160 -
180 - 280 °C при скорости нагревания 10 - 5 - 25 °C/мин.; расход газа-носителя
(азот) - 30 куб. см/мин.; деление потока 1:10.
Время удерживания:
- уксусной кислоты - 21 мин. (47 +/- 23) с;
- пропионовой
кислоты - 23 мин. (47 +/- 23) с;
- изомасляной кислоты - 24 мин. (9 +/-
23) с;
- масляной кислоты - 25 мин. (43 +/- 23) с;
- валериановой кислоты - 29 мин. (46 +/-
23) с;
- изокапроновой
кислоты - 32 мин. (22 +/- 23) с;
- капроновой кислоты - 34 мин. (29 +/-
23) с.
Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:
n
SUM C / S
i=1 i i
K = -----------,
n
C - концентрация вещества в градуировочной смеси, мкг/куб. см;
i
S - среднее значение пяти измерений площади пика i-ой концентрации,
i
расхождение между минимальным и максимальным значением которых не должно
превышать 4% сигнала милливольт (Мв);
n - количество градуировочных смесей (n = 5).
8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной
характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений.
Образцами для контроля стабильности являются градуировочные
растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация летучих жирных
кислот соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения
градуировочной характеристики. Градуировка признается
стабильной при выполнении условия:
|X - C| <= 0,10 x C,
где:
C - заданная концентрация кислоты в градуировочном растворе;
X - результат измерения массовой
концентрации кислоты в градуировочном растворе.
При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с
другим градуировочным раствором. При повторном
невыполнении условия стабильности градуировочной
характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной
характеристики.
8.5. Отбор проб
Отбор проб венозной крови объемом не
менее 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой
пробкой. Анализ крови проводят в течение суток. Возможно хранение пробы крови в
морозильной камере не более пяти дней.
9. Выполнение
измерений
Отбирают 2 куб. см крови и помещают в
химически чистую центрифужную пробирку вместимостью
10 куб. см, добавляют 0,5 куб. см 1%-ного раствора
серной кислоты до достижения pH 2 - 3 и экстрагируют
2 куб. см изобутанола в течение 10 мин. Экстракт
центрифугируют при 6000 об./мин.
в течение 10 мин., надосадочную жидкость переносят в
бюкс, прибавляют 0,1 куб. см 0,4%-ного раствора
щелочи. Раствор упаривают досуха, добавляют 0,05 куб. см 1%-ного
раствора серной кислоты, 0,1 куб. см изобутанола и
проводят количественное определение кислот в подготовленной пробе
газохроматографическим методом. Для каждого образца делают по три ввода
подготовленной пробы.
Условия выполнения измерений по п. 8.4.3.
10. Обработка
(вычисление) результатов измерений
10.1. Концентрацию анализируемых кислот в
крови C, мкг/куб. см, рассчитывают по формуле:
V x A
1
C = K
------, (1)
V x B
2
где:
V - объем рабочего раствора, куб. см;
1
V - объем вводимой пробы, куб. мм;
2
A - количество компонента в объеме
вводимой пробы, найденное по калибровочному графику, мкг;
B - объем крови, куб. см;
K - коэффициент пересчета, учитывающий
степень экстракции кислот из крови. Коэффициент устанавливается в результате
расчета отношения площадей хроматографических пиков,
полученных при анализе стандартного образца до и после экстракции:
K = 2,100;
уксусная кислота
K = 1,500;
пропионовая кислота
K = 1,140;
изомасляная кислота
K = 1,220;
масляная кислота
K = 1,095;
валериановая кислота
K = 1,050;
изокапроновая кислота
K = 1,140.
капроновая кислота
_
За результат измерения принимают среднее арифметическое значение C двух
результатов измерений, полученных в условиях повторяемости C , C
max min
(параллельных определений), для которых выполняется условие:
C + C
1 2
|C - C | <= 0,01 x r x -------, (2)
1 2 2
где r - предел повторяемости. Значения
предела повторяемости приведены в табл. 4.
Таблица 4
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ,
ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
И КРИТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ
ВЕРОЯТНОСТИ
P = 0,95
┌────────────┬──────────────────┬────────────────────────┬────────────────┐
│ Диапазон │Предел повторяемо-│Предел внутрилаборатор- │Предел воспроиз-│
│ измерений,│сти (относительное│ной прецизионности (от- │водимости (отно-│
│ мкг/куб. см│значение допускае-│носительное значение до-│сительное значе-│
│ │мого расхождения │пускаемого расхождения │ние допускаемого│
│ │между двумя резу- │между двумя результатами│расхождения меж-│
│ │льтатами измере- │измерений, полученными в│ду двумя резуль-│
│ │ний, полученными в│одной лаборатории в ус- │татами измере- │
│ │одной лаборатории │ловиях внутрилаборатор- │ний, полученными│
│ │в условиях повто- │ной прецизионности), │в разных лабора-│
│ │ряемости), r, % │R , % │ториях), R, % │
│ │ │ л │ │
├────────────┼──────────────────┼────────────────────────┼────────────────┤
│От 0,5 │25 │28 │31 │
│до 1 включ. │ │ │ │
├────────────┼──────────────────┼────────────────────────┼────────────────┤
│Св. 1 │17 │20 │22 │
│до 16 включ.│ │ │ │
└────────────┴──────────────────┴────────────────────────┴────────────────┘
При невыполнении условия (2) получают
дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее
арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях
повторяемости, для которых выполняется условие:
C + C +
C + C
1 2 3
4
|C - C
| <= 0,01 x CR (4) x
-----------------, (3)
max,4 min,4 0,95 4
где CR (4) - критический диапазон. Значения предела повторяемости
0,95
приведены в табл. 4.
10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух
лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:
C + C
_ _ 1 2
|C - C | <= 0,01 x R x -------, (4)
1 2 2
_ _
где C и C - результаты измерений массовых концентраций летучих жирных
1 2
кислот, полученные в разных лабораториях, - средние арифметические двух
результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых
выполняется условие (4).
В случае, если
содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых
концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание уксусной
кислоты в пробе менее 3,0 мкг/куб. см, где 3,0 мкг/куб. см - предел
обнаружения".
При выполнении условия (4) приемлемы оба
результата измерений и в качестве окончательного может быть использовано их
среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости
приведены в табл. 4.
10. Оформление
результатов измерений
_
Результат измерения представляют в виде (C +/- ДЕЛЬТА) мкг/куб. см, где
ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при P = 0,95, значение
ДЕЛЬТА рассчитывают по формуле:
_
дельта x C
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где значение дельта приведено в табл. 2.
Примечание. При представлении результата
измерений в документах, выдаваемых лабораторией, указывают:
- количество результатов параллельных
определений, использованных для расчета результата измерений;
- способ определения результата измерений
(среднее арифметическое значение или медиана результатов параллельных
определений).
12. Контроль
стабильности результатов измерений
в пределах лаборатории
Контроль стабильности результатов
измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [8] и рекомендациями по межгосударственной
стандартизации РМГ 76-2004 ГСИ [9].
Периодичность получения результатов
контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории,
устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов
контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.
13. Алгоритм
оперативного контроля процедуры измерений
с использованием метода добавок
Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения
результата отдельно взятой контрольной процедуры K с нормативом контроля
к
K.
Результат контрольной процедуры K рассчитывают по формуле:
к
_ _
K = |C' - C - C |,
к д
где:
_
C' - результат измерений массовой концентрации кислоты в пробе с
известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений,
полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми
удовлетворяет условию (2);
_
C - результат измерений массовой концентрации кислоты в исходной пробе
- среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях
повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2).
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
_________________________
/ 2 2
K = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА ,
л,C' л,C
ср ср
2 2
где ДЕЛЬТА , ДЕЛЬТА - значения характеристики погрешности
л,C' л,C
ср ср
результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации
методики, соответствующие массовой концентрации кислоты в пробе с известной
добавкой и в исходной пробе соответственно.
Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений
при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения:
ДЕЛЬТА = 0,84 x ДЕЛЬТА, с последующим уточнением по мере накопления
л
информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.
Процедуру измерений признают удовлетворительной, при выполнении
условия:
K <= K. (5)
к
При невыполнении условия (5) контрольную
процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (5) выясняют причины,
приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их
устранению.
14. Алгоритм
проведения контрольной процедуры при контроле
внутрилабораторной прецизионности
Контрольные процедуры при контроле
промежуточной прецизионности получают с
использованием рабочих проб крови.
При реализации контрольной процедуры получают два результата
контрольных измерений (первичного C и повторного C ) массовой концентрации
1 2
летучих жирных кислот в условиях внутрилабораторной прецизионности.
Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при
выполнении следующего условия:
_ _
C + C
_ _ 1 2
|C - C | <= 0,01 x R x -------.
1 2 n 2
Значения предела внутрилабораторной
прецизионности приведены в табл. 5.
Таблица 5
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛА ВНУТРИЛАБОРАТОРНОЙ
ПРЕЦИЗИОННОСТИ
ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95
┌──────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐
│ Диапазон │ Предел внутрилабораторной прецизионности │
│ измерений, │(относительное значение допускаемого расхождения между│
│ мкг/куб. см │ двумя результатами измерений, полученными в одной │
│ │ лаборатории в условиях внутрилабораторной │
│ │ прецизионности), R , % │
│ │ л │
├──────────────────┼──────────────────────────────────────────────────────┤
│От 0,5 до 1 включ.│28 │
├──────────────────┼──────────────────────────────────────────────────────┤
│Св. 1 -"- 16 -"- │20 │
└──────────────────┴──────────────────────────────────────────────────────┘
Приложение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вредные вещества в промышленности.
Органические вещества. Справочник для химиков, инженеров и врачей/ Н.В.
Лазарев, Э.Н. Левина. Издательство "Химия", 1976.
2. ГОСТ 12.1.004-91. Пожарная
безопасность. Общие требования. Дата введения 01.07.92.
3. ГОСТ 12.4.009-83. Пожарная техника для
защиты объектов. Межгосударственный стандарт. Дата введения 01.01.1985.
4. ГОСТ 12.1.019-79* 2001.
Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда.
Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты. Дата
введения 01.07.1980.
5. ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов
безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования
безопасности. Дата введения 1977-01-01.
6. ГОСТ 12.1.005-88. Общие
санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны. Дата введения
01.01.1989.
7. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с
микроорганизмами третьей, четвертой групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней.
8. ГОСТ Р ИСО
5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность)
методов и результатов измерений".
9. РМГ 76-2004 "ГСИ. Внутренний
контроль качества результатов количественного химического анализа".