"МУК 4.1.2771-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовых концентраций формальдегида, ацетальдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида и ацетона в желчи методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указ // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

22 ноября 2010 года

Дата введения -

с момента утверждения

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФОРМАЛЬДЕГИДА,

АЦЕТАЛЬДЕГИДА, ПРОПИОНОВОГО АЛЬДЕГИДА, МАСЛЯНОГО АЛЬДЕГИДА

И АЦЕТОНА В ЖЕЛЧИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.1.2771-10

1. Разработаны Федеральным государственным учреждением науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22 ноября 2010 г.

4. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Свидетельство о метрологической аттестации N 223.1.11.11.95/2009.

1.1. Методические указания по определению массовых концентраций альдегидов (формальдегида, ацетальдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида) и ацетона в желчи предназначены для использования территориальными органами и подведомственными организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.2. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием альдегидов и ацетона в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

1.3. Формальдегид (HCHO), молекулярная масса 30,03.

Формальдегид (муравьиный альдегид, метаналь) - 00бесцветный газ с резким раздражающим запахом. Температура кипения: -19,2 °C, плотность: 0,8153 г/куб. см. Хорошо растворим в воде, спиртах и других полярных растворителях. При низких температурах смешивается с неполярными растворителями (толуолом, диэтиловым эфиром, этилацетатом) [пункт 5 Приложения к настоящему МУК] <*>. Обладает раздражающим, сенсибилизирующим и кожно-резорбтивным действием, оказывает гепатотропный эффект, относится к веществам, обуславливающим канцерогенную опасность [3].

--------------------------------

<*> Далее по тексту ссылка на номер пункта Приложения указывается одним номером в квадратных скобках.

1.4. Ацетальдегид (CH CHO), молекулярная масса 44,05.

Ацетальдегид (уксусный альдегид) - бесцветная жидкость с удушающим запахом. Температура кипения: 20,16 °C, плотность: 0,778 г/куб. см. Смешивается во всех соотношениях с водой и большинством органических растворителей [1]. Оказывает наркотическое, раздражающее, мутагенное и канцерогенное действие [3].

1.5. Пропионовый альдегид (CH CH CHO), молекулярная масса 58,08.

3 2

Пропионовый альдегид (пропаналь) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Температура кипения: 48,8 °C, плотность: 0,8058 г/куб. см. Растворим в воде, смешивается со многими органическими растворителями [4]. Оказывает наркотическое действие, вызывает изменения со стороны дыхательной системы, паренхиматозных органов, угнетает гемопоэз [3].

1.6. Масляный альдегид (CH (CH ) CHO), молекулярная масса 72,11.

3 2 2

Масляный альдегид (бутаналь) - бесцветная прозрачная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 75,7 °C, плотность: 0,817 г/куб. см [2]. Растворим в воде, смешивается со многими органическими растворителями. Оказывает наркотическое, раздражающее и кожно-резорбтивное действие [3].

1.7. Ацетон (CH COCH ), молекулярная масса 58,08.

3 3

Ацетон (диметилкетон) - летучая бесцветная жидкость с характерным запахом. Температура кипения: 56,1 °C, плотность: 0,792 г/куб. см [1]. Смешивается с водой и органическими растворителями (эфиром, хлороформом, бензолом, четыреххлористым углеродом). Обладает наркотическим и кожно-резорбтивным действием, угнетает репродуктивную функцию. Преимущественно действует на центральную нервную систему [3].

1.8. Диапазон измерений массовых концентраций альдегидов и ацетона приведен в табл. 1.

Таблица 1

НАЗВАНИЕ ОПРЕДЕЛЯЕМОГО ВЕЩЕСТВА И ДИАПАЗОНЫ ИЗМЕРЕНИЙ

┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐

│ Название определяемого вещества │ Диапазон измерений, мкг/куб. см │

├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤

│Формальдегид │От 0,001 до 0,1 включ. │

│Ацетальдегид │-"- 0,001 -"- 0,1 -"- │

│Пропионовый альдегид │-"- 0,001 -"- 0,1 -"- │

│Масляный альдегид │-"- 0,001 -"- 0,1 -"- │

│Ацетон │-"- 0,01 -"- 2,0 -"- │

└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘

2. Приписанные характеристики погрешности измерений

Методика обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2.

Таблица 2

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,

ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВНУТРИЛАБОРАТОРНОЙ ПРЕЦИЗИОННОСТИ,

ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

┌──────────────┬─────────────┬────────────────┬──────────────┬────────────┐

│ Диапазон │Показатель │Показатель вну- │Показатель во-│Показатель │

│ измерений, │повторяемости│трилабораторной │спроизводимо- │точности <*>│

│ мкг/куб. см │(относитель- │прецизионности │сти (относи- │(границы │

│ │ное значение │(относительное │тельное значе-│относитель- │

│ │среднеквадра-│значение средне-│ние среднеква-│ной погреш- │

│ │тического от-│квадратического │дратического │ности при │

│ │клонения пов-│отклонения внут-│отклонения во-│вероятности │

│ │торяемости), │рилабораторной │спроизводимо- │P = 0,95), │

│ │сигма , % │прецизионности),│сти), сигма , │+/- дельта, │

│ │ r │сигма , % │ R │% │

│ │ │ Rл │% │ │

├──────────────┼─────────────┼────────────────┼──────────────┼────────────┤

│От 0,001 │6 │ 12 │15 │ 30 │

│до 0,01 включ.│ │ │ │ │

│Св. 0,01 │5 │ 8 │10,5 │ 21 │

│-"- 0,1 -"- │ │ │ │ │

│-"- 0,1 │4 │ 5 │6 │ 12 │

│-"- 2 -"- │ │ │ │ │

├──────────────┴─────────────┴────────────────┴──────────────┴────────────┤

│ <*> Соответствует относительной расширенной неопределенности│

│измерений при коэффициенте охвата 2 │

└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

3. Сущность метода

Методика основана на предварительном переводе альдегидов и ацетона в производные 2,4-динитрофенилгидразина, концентрировании продуктов дериватизации из биологического материала экстракцией гексаном и количественном определении полученных гидразонов альдегидов и ацетона на жидкостном хроматографе с УФ-детектором.

Измерению не мешают спирты, органические кислоты, кетоны и другие альдегиды.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства,

материалы, растворы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы:

4.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01

Гири Г -210 ГОСТ 7328-01

Термометр стеклянный ГОСТ 28498-90

Микрошприцы МШ-1, МШ-10 ТУ 2.833.106-00

Цилиндр мерный вместимостью 50 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные вместимостью

1, 2, 5 куб. см ГОСТ 29227-91

Пипетка градуированная вместимостью 0,1 куб. см ГОСТ 20292-74

Колбы мерные вместимостью

100, 200, 500, 1000, 2000 куб. см

Термостойкий стакан вместимостью 2000 куб. см

Пробирки мерные вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770-74

Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73

Стандартные образцы:

Формальдегид в воде с концентрацией

1,0 мг/куб. см ГСО 7347-96

Ацетон в воде с концентрацией 1,0 мг/куб. см ГСО 8460-2003

4.2. Вспомогательные устройства

Колонка хроматографическая металлическая

(длина 80 мм, внутренний диаметр 2 мм)

с сорбентом Диасорб С зернением 5 - 6 - 7 мкм

Предколонка металлическая 12 x 1,5 мм,

заполненная сорбентом Диасорб С

Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон" ТУ 9443-001-245.23530-97

Дистиллятор ТУ 61-1-721-79

Сушильный шкаф ШСС-80 П УХЛ 4.2 ТУ 16.531.743-83

Дефлегматор длиной 300 мм ГОСТ 25336-82

Холодильник шариковый ХШ-300 (6 шар.) ГОСТ 1770-74

Холодильник прямой ХПТ-3-300 ГОСТ 1770-74

Воронка Шотта (пор 16) ГОСТ 25336-82

Воронки делительные вместимостью 100 куб. см ГОСТ 23932-90

Бюксы СВ 19/9 ТУ 92-891.029-91

Колбы для перегонки круглодонные вместимостью

1,0; 2,0 куб. дм ГОСТ 25336-82

Стакан термостойкий вместимостью 2 куб. дм ГОСТ 25336-82

Пробирки центрифужные пропиленовые

с завинчивающейся крышкой вместимостью

15 куб. см

Фильтры обеззоленные "Синяя лента" ТУ 2642-001-42624157-98

Универсальная индикаторная бумага pH 1,0 - 10,0 ПНД 50-975-84

4.3. Реактивы

Гексан для хроматографии, ос.ч. ТУ 6-09-4521-77

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ос.ч. ТУ 6-09-14-2167-84

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Ацетальдегид для хроматографии, чистота

не менее 99,5%

Пропионовый альдегид для хроматографии,

чистота не менее 99,5%

Масляный альдегид для хроматографии,

чистота не менее 99,5%

2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ), ч. ТУ-6-09-2394-77

Кислота хлористоводородная (плотность 1,19), х.ч. ГОСТ 3118-77

Перманганат калия, ч. ГОСТ 20490-75

Спирт этиловый, ректификованный,

из пищевого сырья ГОСТ Р 51652-2000

Калий двухромовокислый, ч.д.а. ГОСТ 4220-75

Серная кислота ГОСТ 4204-77

Уксусная кислота, х.ч. ГОСТ 61-75

Диэтиламин, ч., перегнанный для хроматографии ТУ 6-09-68-89

4.4. Материалы

Гелий газообразный ТУ 51-940-80

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химических реактивов и материалов по метрологическим и техническим характеристикам, не уступающим перечисленным.

5. Требования безопасности

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности по ГОСТ 12.1.007-76 [6] и ГОСТ 12.1.005-88 [7].

5.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации прибора", правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 [8], противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 [9] и имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 [10].

5.3. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 от 01.05.2008 [11].

5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в Руководстве по правилам эксплуатации жидкостного хроматографа.

6. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности анализа.

7. Условия измерений

7.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15 - 25 °C;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °C.

7.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

8. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

8.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в хромовой смеси, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °C.

8.2. Подготовка растворителей

8.2.1. Очистка ацетонитрила от примесей. В колбу вместимостью 2 куб. дм

помещают 1 куб. дм ацетонитрила и 20 г KMnO , кипятят с шариковым

холодильником в течение 1 ч, затем перегоняют с дефлегматором при

температуре 81,6 °C, отбирая фракции по 200 куб. см. Когда в колбе

останется около 200 куб. см продукта, перегонку прекращают. Остаток можно

смешивать с новой порцией растворителя. Первую фракцию (200 куб. см)

отбрасывают, а остальные проверяют на поглощение в УФ-области (оптическая

плотность при 200 нм не должна превышать 0,05 о.е./см).

8.2.2. Очистка диэтиламина от примесей. В колбу вместимостью 1,0 куб. дм помещают 0,5 куб. дм диэтиламина и перегоняют с прямым холодильником. Первые и последние порции (50 куб. см) отбрасывают, оставляют среднюю порцию. Перегнанный раствор должен быть бесцветным.

8.2.3. Очистка этилового спирта от альдегидов и кетонов. К 1 куб. дм 96%-ного спирта добавляют 2 г 2,4-динитрофенилгидразина, 0,5 куб. см концентрированной хлористоводородной кислоты и кипятят с шариковым холодильником 1 ч. Перегоняют с дефлегматором в приборе со стеклянными шлифами, отбрасывая первые и последние 100 куб. см, после этого отгоняют вторично.

8.3. Приготовление растворов

8.3.1. Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 куб. дм насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 куб. дм концентрированной серной кислоты.

8.3.2. Элюент для хроматографии. 600 куб. см ацетонитрила смешивают с 400 куб. см дистиллированной воды. Смесь фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 5 мин. со скоростью 50 - 60 куб. см/мин. Добавляют 25 куб. см уксусной кислоты и 10 куб. см диэтиламина и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения элюента 5 дней в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном месте.

8.3.3. Хлористоводородная кислота, 2 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, наполненную до половины объема дистиллированной водой, прибавляют 61,0 куб. см концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,19 г/куб. см), доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

8.3.4. 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2 М растворе хлористоводородной кислоты. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу на 100 куб. см и доводят до метки 2 М раствором хлористоводородной кислоты.

8.3.5. Исходный раствор альдегидов для градуировки (раствор A).

В мерную колбу объемом 500 куб. см, содержащую 450 куб. см дистиллированной воды, добавляют 5 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина, переносят 4 куб. см ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/куб. см (4,0 мг) и реактивы по п. 4.3 в количестве 5,0 куб. мм (3,9 мг) ацетальдегида, 5,0 куб. мм (4,03 мг) пропионового альдегида, 5,0 куб. мм (4,08 мг) масляного альдегида и доводят дистиллированной водой до метки.

Градуировочные растворы готовят с предварительным охлаждением альдегидов и дистиллированной воды, которые выдерживают при температуре (-10 +/- 2) °C в течение 20 мин. Используют свежеприготовленный раствор. Содержание альдегидов в растворе A составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): формальдегида - 8,0 мкг/куб. см; ацетальдегида - 7,8 мкг/куб. см; пропионового альдегида - 8,1 мкг/куб. см; масляного альдегида - 8,2 мкг/куб. см.

Исходный раствор ацетона для градуировки (раствор B). В мерную колбу объемом 200 куб. см, содержащую 180 куб. см дистиллированной воды, добавляют 5 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина, переносят 5,0 куб. см (3,96 мг) ГСО ацетона и доводят водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор. Содержание ацетона в растворе B составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества) 19,8 мкг/куб. см.

8.3.6. Получение 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и ацетона. В колбу с притертой пробкой вместимостью 500 куб. см вносят 300 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте, прибавляют 0,17 г формальдегида (для получения 2,4-ДНФгидразона ацетальдегида прибавляют 0,24 г ацетальдегида, пропионового альдегида - 0,38 г, масляного альдегида - 0,46 г, ацетона - 0,32 г), перемешивают и оставляют смесь на 12 часов. После выпадения окрашенного осадка 2,4-динитрофенилгидразона соответствующего альдегида или ацетона его отфильтровывают через фильтр "Синяя лента", промывают 100 куб. см 2 М раствора хлористоводородной кислоты, дистиллированной водой до нейтральной реакции среды, которую проверяют по индикаторной бумаге, высушивают на воздухе. Проверяют качество производного методом ВЭЖХ, приемлемый уровень чистоты 99,0% и выше. Если уровень чистоты неудовлетворительный, перекристаллизовывают гидразон из этилового спирта и повторяют проверку качества.

8.4. Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюент, приготовленный в соответствии с п. 8.3.2, со скоростью 100 куб. мм/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

8.5. Установление градуировочной характеристики

8.5.1. Строят две зависимости площади хроматографического пика от концентрации альдегидов и ацетона в желчи в диапазонах 0,001 - 0,020 мкг/куб. см и 0,02 - 0,50 мкг/куб. см - для альдегидов; 0,005 - 0,10 мкг/куб. см и 0,1 - 2,0 мкг/куб. см - для ацетона. Градуировочные характеристики устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят из растворов A и B.

8.5.2. Для приготовления градуировочных смесей отбирается проба желчи объемом 125 куб. см (при сборе желчь хранится при температуре не выше 0 °C). В соответствии с п. 9 проводят анализ пробы желчи на содержание альдегидов. При наличии анализируемых веществ в холостой пробе вычитают их фоновое содержание при построении калибровки.

8.5.3. Градуировочные растворы готовят в мерных пробирках вместимостью 10 куб. см. Для этого в каждую колбу вносят микрошприцем или микропипеткой растворы A и B в соответствии с табл. 3 и 4, доводят объем до 5 куб. см желчью и перемешивают. Анализируют свежеприготовленные растворы.

Таблица 3

РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В ЖЕЛЧИ АЛЬДЕГИДОВ В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ

0,001 - 0,020 МКГ/КУБ. СМ И АЦЕТОНА В ДИАПАЗОНЕ

КОНЦЕНТРАЦИЙ 0,01 - 0,10 МКГ/КУБ. СМ

РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В ЖЕЛЧИ АЛЬДЕГИДОВ В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ

В делительную воронку объемом 100 куб. см помещают 2,0 куб. см градуировочного раствора, разводят дистиллированной водой до объема 40 куб. см, добавляют 2,0 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М растворе хлористоводородной кислоты, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения жидкостей верхний слой переносят в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 5 мин. со скоростью 2800 об./мин., затем 2 куб. см гексана переносят в бюкс и высушивают в потоке воздуха до сухого остатка. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см элюента и анализируют аликвотную часть (10 куб. мм) в условиях:

2,4-динитрофенилгидразона формальдегида 4,1 +/- 0,2 мин.;

2,4-динитрофенилгидразона ацетальдегида 5,0 +/- 0,2 мин.;

2,4-динитрофенилгидразона ацетона 6,2 +/- 0,2 мин.;

2,4-динитрофенилгидразона пропионового альдегида 7,5 +/- 0,2 мин.;

2,4-динитрофенилгидразона масляного альдегида 8,5 +/- 0,2 мин.

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

C - концентрация вещества в градуировочном растворе, мкг/куб. см;

S - среднее значение пяти измерений площади пика i-ой концентрации,

расхождение между минимальным и максимальным значением которых не должно

превышать 4% относительно среднего значения S ;

8.5.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация альдегида (ацетона) соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

C - заданная концентрация альдегида (ацетона) в градуировочном растворе;

X - результат измерения массовой концентрации альдегида (ацетона) в градуировочном растворе.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбор проб желчи в объеме не менее 4 куб. см проводят в чистую пробирку с притертой пробкой. Срок хранения пробы в холодильнике 2 дня.

9.1. Выполняют два параллельных измерения образца желчи. В делительную воронку 100 куб. см помещают 2,0 куб. см желчи, разбавляют дистиллированной водой до объема 40 куб. см, добавляют 2,0 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М растворе хлористоводородной кислоты, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После отстаивания верхний слой переносят в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 5 мин. со скоростью 2800 об./мин. После расслоения жидкостей 2 куб. см гексанового экстракта переносят в бюкс и высушивают в потоке воздуха до сухого остатка. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см элюента, вводят в хроматограф аликвотную часть (10 куб. мм) и анализируют в условиях, указанных в п. 8.5.3.

9.2. Идентификацию хроматографических пиков 2,4-динитрофенилгидразонов формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов и ацетона проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и в растворах 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и ацетона, полученных согласно п. 8.3.6.

10. Обработка (вычисление) результатов измерений

10.1. Массовые концентрации альдегидов и ацетона в желчи (мкг/куб. см) вычисляют по формуле:

X - массовая концентрация вещества в анализируемой пробе, мкг/куб. см;

S - площадь пика соответствующего 2,4-динитрофенилгидразона альдегида

10.2. За результат измерения X принимают среднее арифметическое

значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

X , X (параллельных определений), для которых выполняется условие:

где r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

И КРИТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ

┌───────────────┬──────────────────┬─────────────────────┬────────────────┐

│ Диапазон │Предел повторяемо-│Критический диапазон │Предел воспроиз-│

│ измерений, │сти (относительное│(относительное значе-│водимости (отно-│

│ мкг/куб. см │значение допускае-│ние допускаемого рас-│сительное значе-│

│ │мого расхождения │хождения между наи- │ние допускаемого│

│ │между двумя резу- │большим и наименьшим │расхождения меж-│

│ │льтатами измере- │четырех результатов │ду двумя резуль-│

│ │ний, полученными в│измерений, полученных│татами измере- │

│ │одной лаборатории │в одной лаборатории в│ний, полученными│

│ │в условиях повто- │условиях повторяемо- │в разных лабора-│

├───────────────┼──────────────────┼─────────────────────┼────────────────┤

└───────────────┴──────────────────┴─────────────────────┴────────────────┘

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

где CR (4) - критический диапазон. Значения критического диапазона

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:

где X и X - результаты измерений массовых концентраций альдегидов и

ацетона, полученные в разных лабораториях, - средние арифметические двух

результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 5.

Результат измерения представляют в виде (X + ДЕЛЬТА), мкг/куб. см, где

ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при P = 0,95, значение

В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание альдегида < 0,001 мкг/куб. см, содержание ацетона < 0,01 мкг/куб. см".

12. Контроль стабильности результатов измерений

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6 [12] и РМГ 76-2004 ГСИ [13].

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

13. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения

результата отдельно взятой контрольной процедуры K с нормативом контроля

Результат контрольной процедуры K рассчитывают по формуле:

X' - результат измерений массовой концентрации альдегида (или ацетона)

в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов

измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми

X - результат измерений массовой концентрации альдегида (или ацетона) в

исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений,

полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

где ДЕЛЬТА , ДЕЛЬТА - значения характеристики погрешности

результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации

методики, соответствующие массовой концентрации альдегида (или ацетона) в

пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений

при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения:

ДЕЛЬТА = 0,84 x ДЕЛЬТА, с последующим уточнением по мере накопления

информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб желчи.

При реализации контрольной процедуры получают два результата

контрольных измерений (первичного X и повторного X ) массовой концентрации

альдегида (или ацетона) в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 6.

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛА ВНУТРИЛАБОРАТОРНОЙ ПРЕЦИЗИОННОСТИ

┌───────────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│ Диапазон │ Предел внутрилабораторной прецизионности │

│измерений, мкг/куб. см │(относительное значение допускаемого расхождения │

│ │между двумя результатами измерений, полученными в│

│ │ одной лаборатории в условиях внутрилабораторной │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

└───────────────────────┴─────────────────────────────────────────────────┘

1. Химическая энциклопедия/ Под. ред. И.Л. Кнунянц. М.: "Советская энциклопедия", 1988. Т. 1.

2. Химическая энциклопедия/ Под. ред. И.Л. Кнунянц. М.: "Советская энциклопедия", 1990. Т. 2.

3. Филов В.А., Тиунов Л.А. Справ.: Вредные химические вещества. Галоген- и кислородсодержащие органические соединения. С.-П.: "Химия", 1994.

4. Химическая энциклопедия/ Под. ред. Н.С. Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.

5. Химическая энциклопедия/ Под. ред. Н.С. Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1999. Т. 5.

6. ГОСТ 12.1.007-76 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

7. ГОСТ 12.1.005-88 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

8. ГОСТ 12.1.019-79 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

9. ГОСТ 12.1.004-91 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

10. ГОСТ 12.4.009-90 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

11. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 от 01.05.2008 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

12. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13. РМГ 76-2004 "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Номер раствора	1	2	3	4	5
Объем раствора A, куб. мм	0,6	1,2	2,6	6,0	12,0
Массовая концентрация формальдегида, мкг/куб. см	0,001	0,002	0,004	0,010	0,020
Массовая концентрация ацетальдегида, мкг/куб. см	0,001	0,002	0,004	0,010	0,020
Массовая концентрация пропионового альдегида, мкг/куб. см	0,001	0,002	0,004	0,010	0,020
Массовая концентрация масляного альдегида, мкг/куб. см	0,001	0,002	0,004	0,010	0,020
Объем раствора B, куб. мм	2,6	5,0	12,6	20,0	25,0
Массовая концентрация ацетона, мкг/куб. см	0,01	0,02	0,05	0,08	0,10

Номер раствора	1	2	3	4	5
Объем раствора A, куб. мм	12,0	24,0	36,0	48,0	60,0
Массовая концентрация формальдегида, мкг/куб. см	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10
Массовая концентрация ацетальдегида, мкг/куб. см	0,02	0,04	0,06	0,08	0,09
Массовая концентрация пропионового альдегида, мкг/куб. см	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10
Массовая концентрация масляного альдегида, мкг/куб. см	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10
Объем раствора B, куб. мм	25,0	50,0	125,0	250,0	500,0
Массовая концентрация ацетона, мкг/куб. см	0,1	0,2	0,5	1,0	2,0