Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 сентября 2010 года
Дата введения:
с момента подписания
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ПОРЯДОК
ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
ПРИ ОБСЛЕДОВАНИИ ОЧАГОВ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ
С ГРУППОВОЙ ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬЮ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2746-10
1. Методические указания разработаны
Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека, ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт
эпидемиологии" Роспотребнадзора.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией
по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной
службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
(протокол _____ от _______ 2010 года).
3. Утверждены Руководителем Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30
сентября 2010 года.
4. Введены в действие с 30 сентября 2010
года.
5. Введены впервые.
1. Область
применения
1.1. В настоящих методических указаниях
определены порядок применения молекулярно-генетических методов исследования, а
также сбора, упаковки, хранения и транспортирования биологического материала и
образцов объектов окружающей среды (ООС) при обследовании очагов острых кишечных
инфекций с групповой заболеваемостью различной этиологии, вызванных ПБА III -
IV группы, не относящимися к условно-патогенной флоре
(УПФ).
1.2. Методические указания предназначены
для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть
использованы лечебно-профилактическими и другими учреждениями, независимо от
ведомственной принадлежности и организационно-правовой формы.
2. Список
сокращений
ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
ЖКТ желудочно-кишечный тракт
ОКИ острые кишечные инфекции
ООС объекты окружающей среды
ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной
транскрипцией
ПБА патологические биологические агенты
ПЦР полимеразная цепная реакция
УПФ условно-патогенная флора
AFLP оценка полиморфизма длины фрагментов
амплификации
EIEC энтероинвазивные E. coli
LCR лигазная цепная реакция
MLST мультилокусное секвенирование-типирование
NASBA метод изотермической амплификации РНК
(Nucleic Acids Seaquencence
Amplification)
PFGE электрофорез в пульсирующем поле
RAPD амплификации со случайными
праймерами
VNTR амплификация тандемных повторов с
переменной копийностью.
3. Общие положения
К молекулярно-генетическим методам
исследования относятся методы выявления и характеристики инфекционных агентов
на основе исследования их нуклеиновых кислот с применением или без применения
амплификационных технологий путем определения наличия, размера и нуклеотидного
состава различных элементов генома возбудителя либо сочетания этих подходов.
Наибольшее распространение получили
амплификационные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для
выявления ее продуктов применяются методы гель-электрофореза,
гибридизации с флуоресцентно-мечеными зондами, гибридизационно-ферментное
выявление продуктов ПЦР и способы детальной характеристики продукта с
применением нуклеотидных биочипов и метода прямого секвенирования нуклеотидных
последовательностей продуктов реакции.
Достаточно широкое распространение имеют
также методы анализа генома возбудителя без применения амплификационных
технологий. Наиболее распространенным из них является метод электрофореза в
пульсирующем поле.
Применение молекулярно-генетических
методов исследования должно рассматриваться не как альтернатива, а как
обязательное дополнение к регламентированным схемам диагностики острых кишечных
инфекций, позволяющее эффективно выявлять комплекс вирусных возбудителей ОКИ и
проводить оценку идентичности бактериальных и вирусных изолятов.
4. Организация
исследований
4.1. Лабораторные исследования проводятся
в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.
4.2. Молекулярно-генетические методы
исследования в очагах ОКИ с групповой заболеваемостью применяются для решения
следующих задач:
- наиболее раннего установления этиологии
заболеваний с целью своевременного начала адекватной терапии и проведения
соответствующих санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий;
- выявления ДНК/РНК возбудителей в
предполагаемых факторах передачи и источниках инфицирования;
- оценки идентичности изолятов
возбудителей, выделенных из различных материалов с целью определения источников
инфицирования и факторов передачи инфекции.
4.3. Применение молекулярно-генетических
методов исследования является обязательным в случае исследования материала из
очагов ОКИ с групповой заболеваемостью при:
- регистрации в очаге групповой
заболеваемости ОКИ летальных исходов от данных заболеваний, в том числе
установленной этиологии;
- отсутствии
выделения от пациентов (> 30% обследованных) безусловных патогенов в сроки,
регламентированные действующими нормативно-методическими документами;
- выделении от
больных только условно-патогенной флоры в единичных случаях, без достоверно
выявленного фактора передачи возбудителя;
- проведении
детекции вирусных агентов в материалах из окружающей среды, продуктов питания
или лиц - предполагаемых источников инфицирования;
- проведении
оценки идентичности изолятов микроорганизмов, выявленных из различных
источников и нерезультативном применении при этом комплекса классических
микробиологических и серологических методик.
4.4. При работе в эпидемических очагах
ОКИ количество обследуемых больных, лиц, подвергшихся риску заражения,
декретированного контингента, образцов ООС и выделенных изолятов возбудителей
определяется специалистами, уполномоченными осуществлять государственный
санитарно-эпидемиологический надзор в соответствии с действующими
нормативно-методическими документами.
4.5. Для обеспечения контроля качества
проводимых исследований целесообразно дополнительно направлять на исследование
клинический материал от лиц без клинических проявлений заболевания, не имеющих
эпидемиологической связи с обследуемым очагом в количестве ~ 20% от
пострадавших со вспышки в виде единой зашифрованной панели.
Клинический материал от лиц -
предполагаемых источников инфицирования не подлежит зашифровке в целях
правильной организации лабораторных исследований.
4.6. Первичное молекулярно-генетическое
исследование (ПЦР-диагностика) клинического материала от больных проводится в
лабораториях лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), ФГУЗ "Центр
гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, имеющих в своем
составе ПЦР-лаборатории.
4.7. Первичное молекулярно-генетическое
исследование предполагаемых источников инфицирования, лиц, подвергшихся
заражению, и ООС осуществляют на базе ФГУЗ "Центр гигиены и
эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, имеющих в своем составе
ПЦР-лаборатории.
4.8. Региональные
центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней
(региональные центры) Роспотребнадзора проводят исследования по оценке
идентичности возбудителей, выявленных у пострадавших, лиц - предполагаемых
источников инфицирования и ООС (при наличии необходимого оборудования и
квалификации персонала), а также оказывают помощь ФГУЗ "Центр гигиены и
эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации при исследовании больших
объемов материала. Оценка идентичности культур микроорганизмов
проводится только в отношении тех штаммов, которые были расценены как
идентичные при проведении микробиологической диагностики.
При невозможности проведения работ по
оценке идентичности изолятов в условиях региональных центров Роспотребнадзора,
материал для данных исследований направляется в референс-центр по мониторингу
за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН "Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора, 111123,
г. Москва, ул. Новогиреевская, 3).
4.9. При получении отрицательных
результатов первичного исследования клинического материала от больных и при
получении дискордантных результатов исследований в региональных центрах,
первичный клинический материал, образцы проб ООС и выделенные культуры
возбудителей направляются для исследования в референс-центр по мониторингу за
возбудителями острых кишечных инфекций.
4.10. Референс-центр по мониторингу за
возбудителями острых кишечных инфекций оказывает информационно-методическую
поддержку деятельности органов и учреждений Роспотребнадзора.
4.11. ФГУЗ "Центр гигиены и
эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации ежемесячно представляют
информацию об этиологической расшифровке очагов ОКИ с групповой заболеваемостью
(от 5-ти случаев) в региональные центры по мониторингу за инфекционными и
паразитарными болезнями (Приложение 2 без графы 12).
4.12. Региональные центры
Роспотребнадзора ежеквартально (до 15-го числа следующего месяца) направляют
информацию о результатах этиологической верификации очагов ОКИ с групповой
заболеваемостью в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых
кишечных инфекций в разрезе курируемых территорий.
4.13. Референс-центр по
мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций ежегодно (до 15-го марта
следующего за отчетным года) направляет в Федеральную службу по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека отчет о регистрации и
этиологической верификации очагов ОКИ с групповой заболеваемостью на территории
Российской Федерации, а также рекомендации по совершенствованию применяемых при
их расследовании методов лабораторной диагностики.
5. Правила сбора,
хранения и транспортировки клинического
материала и образцов объектов окружающей среды
5.1. Сбор, хранение и транспортировка
клинического материала и образцов ООС осуществляется в соответствии с
действующими нормативно-методическими документами и инструкциями к используемым
тест-системам.
5.2. Лабораторным исследованиям подлежат
следующие материалы:
- клинический материал от пострадавших
лиц, полученный в первые 72 часа от начала заболевания
и не позднее 1 дня госпитализации (фекалии, взятые в объеме 2 - 5 мл, рвотные
массы, по согласованию - мазки из ротоглотки и другие типы клинического
материала);
- аутопсийный материал (фекалии,
фрагменты стенки различных отделов ЖКТ);
- клинический материал от лиц -
предполагаемых источников инфицирования (фекалии, взятые в объеме 2 - 5 мл, или
ректальные мазки (Приложение 1), рвотные массы, по согласованию - образцы крови
и другие типы клинического материала). Сбор ректальных мазков следует проводить
только при невозможности получения фекалий в виде объемной пробы;
- образцы объектов окружающей среды
(ООС), как предполагаемых факторов передачи заболевания. Объем выборки ООС
(продукты питания, концентраты образцов воды) определяется специалистами,
уполномоченными осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический
надзор. При исследовании продуктов питания обязательным является исследование
смывов с их упаковок, поэтому продукты питания для исследования необходимо
предоставлять в целой упаковке;
- культуры штаммов микроорганизмов,
выделенных при проведении исследований клинического материала или ООС на
транспортных средах.
5.3. Не допускается транспортировка клинического
материала от больных и выделенных культур микроорганизмов в одном контейнере с
образцами ООС и материалом от лиц - предполагаемых источников инфицирования.
5.4. В учреждении, осуществляющем
первичное исследование материала, каждый образец клинического материала и ООС
делится на две части, одна из которых подвергается исследованию, а другая
хранится для обеспечения возможности ее исследования в региональном центре или
референс-центре по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций.
6. Порядок
проведения лабораторных исследований
6.1. Лабораторные исследования для
установления этиологии заболеваний и выявления аналогичных возбудителей в ООС и
лиц - предполагаемых источников инфицирования, организуемые на базе лабораторий
ЛПУ, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской
Федерации и Региональных центрах Роспотребнадзора, проводят с использованием
диагностических тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
Для выявления патогенов методом ПЦР
(ОТ-ПЦР) предпочтение должно отдаваться диагностическим тест-системам, которые
обеспечивают максимальную контаминационную безопасность исследований
(тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, с возможностью
использования деконтаминационных процедур на основе принципа пост-ПЦР
стерилизации).
Референс-центр по мониторингу за
возбудителями острых кишечных инфекций использует в своей работе весь доступный
комплекс молекулярно-генетических методик.
6.2. Минимальный спектр исследований
клинического материала от пострадавших при вспышках ОКИ должен включать
детекцию:
- норовирусов 2 генотипа;
- ротавирусов группы A;
- микроорганизмов рода Shigella и
энтероинвазивных E. coli (EIEC);
- микроорганизмов рода Salmonella;
- термофильной группы микроорганизмов
рода Campylobacter.
Для детекции ротавирусов группы A в
клиническом материале могут альтернативно применяться диагностические
тест-системы на основе ИФА или латекс-агглютинации при наличии данных о их валидации относительно тест-систем, рекомендованных для
использования ВОЗ.
Для детекции перечисленных групп
бактериальных возбудителей обязательно параллельное применение
бактериологической диагностики, проводимой в соответствии с действующими
нормативно-методическими документами, с получением чистых культур возбудителей
для возможного проведения впоследствии оценки их идентичности.
6.3. При неинформативности исследования
на первичный спектр микроорганизмов или наличии дополнительных
клинико-эпидемиологических данных в данный спектр исследований целесообразно
включать возбудителей астровирусной инфекции, аденовирусной инфекции, тифо-паратифозных заболеваний, иерсиниозов, эшерихиозов.
При наличии клинико-эпидемиологических
данных, не позволяющих исключить у пациента холеру, лабораторное исследование
материала проводится в соответствии с действующими нормативно-методическими
документами.
6.4. Лабораторное исследование материала
от пострадавших на наличие возбудителей острых кишечных инфекций вирусной и
бактериальной этиологии, вызванных ПБА III - IV группы, проводится в течение
24-х часов с момента его поступления в лабораторию. При поступлении в
лабораторию большого количества образцов и невозможности их исследования в
полном объеме, формируется репрезентативная выборка, исследование которой производится
в вышеуказанные сроки, с последующим проведением полного объема исследований.
6.5. Лабораторные исследования по
установлению идентичности изолятов микроорганизмов проводятся с применением
молекулярно-генетических методик, обеспечивающих:
- необходимую для исследований
разрешающую способность (способность дифференцировки штаммов микроорганизмов,
циркулирующих на данной территории);
- межлабораторную воспроизводимость
результатов исследований;
- низкий риск получения невалидных
результатов исследования в комплексе с применением диагностических тест-систем.
6.6. В отношении возбудителей вирусной
этиологии используются методы, основанные на прямом
секвенировании вариабельного участка (участков) их генома. Для
исключения получения ложноположительных результатов методом прямого
секвенирования исследуются смещенные или альтернативные по отношению к
используемым для диагностики области генома возбудителя. Предпочтение
должно отдаваться методикам, позволяющим провести исследование возможно более
протяженного участка генома возбудителя.
6.7. В отношении возбудителей
бактериальной этиологии, используются методы, минимизирующие возможность
субъективной оценки их результатов. Предпочтение должно отдаваться широко
используемым в мире методикам, позволяющим провести сопоставление получаемых
результатов с международными данными (мультилокусное секвенирование-типирование
- MLST и его варианты, амплификация тандемных повторов с переменной копийностью
- VNTR и его варианты, электрофорез в пульсирующем поле - PFGE, оценка
полиморфизма длины фрагментов амплификации - AFLP). Желательно более широкое
применение методик, основанных на прямом
секвенировании участка (участков) генома возбудителя, как методик,
обеспечивающих абсолютную воспроизводимость исследований.
Не рекомендуется применение методик,
обладающих низкой межлабораторной воспроизводимостью - например
амплификации со случайными праймерами (RAPD) или низкой дифференцирующей
способностью.
6.8. При необходимости проведения
одновременного исследования клинического материала от пострадавших и материалов
с потенциально редким или низким содержанием возбудителя (ООС, предполагаемые
источники инфицирования) придерживаются следующей последовательности выполнения
работ:
1. Обработка материала и выделение
нуклеиновых кислот (без проведения детекции патогенов) из образцов с
потенциально редким или низким содержанием возбудителя (ООС, лица -
предполагаемые источники инфицирования).
2. Обработка и исследование материала от
пострадавших лиц и установление доминирующего возбудителя
или доминирующих возбудителей.
3. Тестирование проб ООС и материала от
лиц - предполагаемых источников инфицирования на наличие доминирующего патогена
или патогенов.
При проведении лабораторной диагностики
заболеваний данной группы следует учитывать возможную крайне высокую
концентрацию их возбудителей в клиническом материале. Особенно характерным это
является для ротавирусов и аденовирусов.
6.9. При проведении исследования
продуктов питания на содержание ПБА наряду с самим продуктом исследуются смывы
с его упаковки.
6.10. При тестировании материалов с
потенциально редким или низким содержанием возбудителя с применением
тест-систем на основе амплификационных технологий количество отрицательных
контролей, прошедших все этапы исследований, должно составлять не менее 20% от
количества исследуемых образцов.
6.11. По результатам проведенных
исследований оформляется заключение, в котором должна быть представлена
следующая информация:
- количество, характер поступивших на
исследование образцов и их состояние после транспортировки (особое внимание
должно уделяться состоянию целостности первичных контейнеров и упаковок
продуктов питания);
- перечень использованных тест-систем;
- полученные результаты исследования.
При проведении исследования части
образцов оформляется предварительное заключение, в котором дополнительно
приводятся сведения о доле исследованных образцов.
6.12. В заключении, оформляемом по
результатам оценки идентичности изолятов, должна быть представлена следующая
информация:
- количество, состояние полученных
культур микроорганизмов;
- краткое описание используемой методики,
с указанием используемого оборудования и программного обеспечения, при
использовании метода прямого секвенирования - размеров и расположения
анализируемых участков генома;
- при использовании методик, результаты
которых имеют форму паттернов (VNTR, AFLP, PFGE) - графическое представление
полученных результатов.
6.13. Организации,
ответственные за проведение данных разделов работы, сохраняют образцы
клинического материала и ООС, культуры микроорганизмов и результаты
исследований в виде первичных материалов (файлы, полученные на детектирующих
приборах) до оформления окончательного донесения об очаге инфекционного
заболевания с групповой заболеваемостью, а при проведении комиссионной судебной
экспертизы в рамках уголовного дела - до истечения срока обжалования решения
суда.
7. Нормативные
ссылки
1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность
работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней" с дополнением СП 1.3.2518-09 от
02.06.2009 N 42.
2. СП 1.2.036-95 "Порядок учета,
хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп
патогенности".
3. МУ 1.3.1888-04 "Организация
работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными
биологическими агентами III - IV групп патогенности".
4. МУК 4.2.2029-05 "Методические
указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов".
5. МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная
диагностика холеры".
Приложение 1
СБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ
ПРОВЕДЕНИЯ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Фекалии
Пробу фекалий (1,0 - 2,0 г) у грудных
детей забирают из подгузника, у пациентов старшего возраста - из помещенного в
горшок или подкладное судно одноразового полиэтиленового пакета или одноразовой
пластиковой емкости (чашка Петри). Затем в количестве 1,0 г (примерно)
переносят в специальный стерильный контейнер. Контейнер с материалом
доставляется в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 сут.
Условия хранения и транспортировки
материала:
- при температуре 2 - 8 °C - в течение 1
суток;
- при температуре минус 20 °C - в течение
1 недели.
Допускается только однократное
замораживание-оттаивание материала.