2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к виду E. sakazakii. Подтверждение принадлежности к E. sakazakii производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20E, Rapid 20E, ID 32E (ф. "БиоМерье", Франция) и др.

Определение биохимических характеристик, дифференцирующих E. sakazakii от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ENTEROBACTER SAKAZAKII

Примечания:

"+" - 90-100% штаммов положительные;

"(+)" - 21-89% штаммов положительные;

"-" - 0-9% штаммов положительные;

"(-)" - 10-24% штаммов положительные.

Ведущими дифференцирующими признаками Enterobacter sakazakii от других представителей вида Enterobacter являются способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при оптимальной температуре 25 град. C и отсутствие ферментации D-сорбита. Для дифференциации E. sakazakii от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест разжижения желатины.

В качестве дополнительного теста при идентификации E. sakazakii возможно определение альфа-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 4-нитрофенил-альфа-d-глюкопиранозид или 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-альфа,d-глюкопиранозид.

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда,

реактивы и питательные среды

3.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность

измерений pH +/- 0,01                                ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П

или других марок, позволяющий поддерживать

температуру (160 +/- 5) град. C                      ТУ 64-1-28-70-76

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую

температуру 37 град. C с отклонением от заданной

+/- 1 град. C                                        ТУ 64-1-1382-83

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую

температуру 41,5 град. C с отклонением от заданной

+/- 1 град. C                                        ТУ 64-1-1382-83

Весы лабораторные общего назначения 2 и 4

класса точности с наибольшим пределом

взвешивания 200 г                                    ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3,

МБР-1, МБР-3, МБС                                    ГОСТ 8284-78

Стерилизаторы паровые медицинские или

аналогичные                                          ГОСТ 19569-89Е

Дистиллятор, обеспечивающий качество

дистиллированной воды в соответствии с               ГОСТ 6709-72

Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2",

"Стомайкер" или других наименований                  AES Lab,

                                                     Cat. N AESAP 1066

Гомогенизатор типа "вортекс"

Микропипетки на 200-1000 мкл                         BIOHIT, Cat. N 720040

                                                     или "Ленпипет"

Облучатель бактерицидный настенный

ОБН-150 или других видов                             ТУ-16-535-84

Холодильник бытовой электрический                    ГОСТ 16317-87

Пинцет медицинский                                   ГОСТ 21241-89

Ножницы медицинские                                  ГОСТ 21239-89

Скальпель хирургический, 15 см                       ГОСТ 21240-89

Часы механические сигнальные                         ГОСТ 3145-84

Электроплитка                                        ГОСТ 14919-83

Аппарат универсальный для встряхивания

жидкости в колбах и пробирках

(или другая аппаратура для встряхивания)             ТУ 64-1-2451-78

3.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная                   ГОСТ 12026-76

Марля медицинская                                    ГОСТ 9412-77

Колбы плоскодонные конические

или круглые разной вместимости                       ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные                                   ГОСТ 25336-82

Вата медицинская гигроскопическая                    ГОСТ 5556-81

Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см            ГОСТ 29227-91

Пробирки типов П1, П2                                ГОСТ 25336-82

Стекла предметные для микропрепаратов                ГОСТ 6672-75

Спиртовки лабораторные стеклянные                    ГОСТ 23932-90

Термометр ртутный с диапазоном измерения

от 0 до 100 град. C (цена деления шкалы 1 град. C)   ГОСТ 13646-68

Чашки биологические (Петри) или одноразовые

из полимерных материалов                             ГОСТ 23932-90

Пакеты стерильные для гомогенизатора                 AES Lab.,

                                                     Cat. N AES400/50G

Отраслевой стандарт для визуальной

оценки мутности N 10                                 ГИСК

                                                     им. Л.А.Тарасевича

Денситометр для бактериальных суспензий

типа "Densi-La-Meter" или "Денсимат"                 ф. "Лахема",

                                                     "BioMerieux"

Стандарт Макфарланда N 1, 2, 3                       ф. "BioMerieux"

Петля бактериологическая

3.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический                              ГОСТ 17206-84

Вода дистиллированная                                ГОСТ 6709-72

D-глюкоза, ч.                                        ГОСТ 6038-79

D-лактоза, 1-водная                                  ТУ 6-09-22-98-79

Маннит

D-сорбит

Рамноза

Калия гидроокись                                     ГОСТ 24363-80

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.              ГОСТ 4198-75

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный          ГОСТ 2493-75

Кислота соляная, х.ч.                                ГОСТ 3118-77

Литий хлористый, ч. или х.ч. или ч.д.а.              ГОСТ 4328-77

Масло иммерсионное для микроскопии                   ГОСТ 31739-78

Набор реактивов для окраски по Граму

Натрий-аммоний фосфорнокислый

двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч.                 ГОСТ 4170-78

Натрия гидроокись, ч.д.а.                            ГОСТ 4328-77

Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а.             ГОСТ 22280-75

Натрий хлористый, ч. или х.ч. или ч.д.а.             ГОСТ 4233-77

Пара-диметиламинобензальдегид, ч.                    ТУ 6-09-3272-77

Пептон сухой ферментативный для

бактериологических целей                             ГОСТ 13805-76

Спирт этиловый ректификованный технический           ГОСТ 18300-87

Спирт этиловый ректификованный                       ГОСТ 5962-67

Феноловый красный                                    ГОСТ 5853-51

Фенолфталеин                                         ГОСТ 5850-72

Фуксин основной                                      ТУ 6-09-4119-75

Хлороформ технический                                ГОСТ 2-15-76-72

Уксусная кислота                                     ГОСТ 61-75

Сульфаниловая кислота

альфа-Нафтол

Цинк порошкообразный                                 ГОСТ 3640

Желатин сухой

Экстракт дрожжевой сухой

Тест-штамм Enterobacter sakazakii, типичный

по культуральным, морфологическим

и биохимическим свойствам                            ГИСК

                                                     им. Л.А.Тарасевича

Пептонная вода забуференная (сухая)

Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон                     ФС 42-3377-97

                                                     (ГНЦПМ)

Питательный бульон и питательный агар                ТУ 10-02-02-789-176-94

Триптон-соевый агар с дрожжевым

экстрактом (TSYEA)                                   HiMedia M1214

Триптон-соевый бульон с дрожжевым

экстрактом (TSYEB)                                   HiMedia M1263

Среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом,

рамнозой, дульцитом, адонитом, сахарозой,

сорбитом                                             ФС (ЦНИИВС

                                                     им. И.И.Мечникова

                                                     НИИ питательных сред)

SIM-arap (сероводород-индол-подвижность)             Difco

Среда Эндо                                           ТУ 9229-072-00419785

Агар желчный фиолетово-красный                       ТУ 9229-072-00419785

Среда Кесслер с глюкозой                             ГОСТ 30519-97

Бульон Мак-Конки с глюкозой                          ГОСТ 30519-97

Бульон с желчью, бриллиантовым зеленым

и глюкозой                                           ГОСТ 30519-97

Тест-системы биохимические для видовой

идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E,

для идентификации Enterobacteriaceae

и других грамотрицательных палочек                   BioMerieux

Набор реактивов для окраски по Граму

Набор для постановки оксидазного теста

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4. Подготовка к анализу

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.2. Приготовление питательных сред

4.2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3., готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

4.2.2. Питательный агар с 5% глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".

4.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.

Состав сред (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 град. C в течение 15 мин.

Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 град. C.

4.2.4. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5-7 куб. см и стерилизуют при 121 град. C в течение 15 мин.

4.2.5. Среды Гисса с углеводами: 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, "ВР" и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 град. C в течение 20 мин.

5. Отбор и подготовка проб к анализу

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать аналитический образец.

5.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров (или неупакованной) пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

5.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.

5.4. Первичный посев исследуемых проб продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

5.5. При отсутствии роста облигатных патогенов, принадлежащих к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но при обнаружении роста сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры в нормируемых навесках исследуемых продуктов, от них отбирают дополнительные пробы (2 навески по 100 г при первичном посеве 100 г продукта, 2 невески по 125 г при первичном посеве 50 г, 2 навески по 137,5 г при первичном посеве 25 г) и анализируют в соответствии с процедурой, изложенной в разделе 6.

6. Проведение анализа

6.1. Пробы продуктов массой 100, 125 или 137,5 г вносят в фосфатный буферный раствор (ФБР) или изотонический раствор (п. 3.3.) в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение (22 +/- 2) ч.

6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (куб. см).

Из подготовленной по п. 5 пробы для анализа отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (куб. см) каждая. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 куб. см ФБР и перемешивают.

Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (куб. см) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (куб. см) и производят посев в 90 куб. см ФБР, перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (куб. см) и производят посев в 9 куб. см ФБР. Для посева (при необходимости - предполагаемом высоком содержании E. sakazakii в продукте) меньших количеств продукта - 0,1; 0,01 г - делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г и вносят по 1 куб. см (х 3) соответствующих разведений в 9 куб. см ФБР.

6.2.1. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 10 куб. см суспензии (1 куб. см - при первичном засеве 1 г или 1 куб. см) пересевают в 90 куб. см (9 куб. см) жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 30519-97 - среду Кесслера с глюкозой, или глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение (22 +/- 2) ч.

6.2.2. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность чашек Петри с одной из агаризованных дифференциально-диагностических сред по п. 3.3. Допускается проводить пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.

Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 24 ч.

6.2.3. При отсутствии роста на чашках с дифференциально-диагностическими средами типа агара Эндо или агара желчного фиолетово-красного анализ прекращают и дают заключение об отсутствии E. sakazakii в исследованной пробе.

6.3. При обнаружении на чашках лактозоположительных колоний дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты, для чего отбирают по 3-5 колоний каждого типа для их дальнейшего изучения.

6.4. Отобранные для исследования 3-5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом по п. 3.3 и термостатируют при температуре 25 град. C в течение 72 ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм E. sakazakii, типичный по фенотипическим свойствам.

6.5. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Enterobacter sakazakii.

7. Подтверждение принадлежности выделенных культур

к Enterobacter sakazakii

7.1. Подтверждение принадлежности выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E.

7.2. К бактериям Enterobacter sakazakii относят культуры, имеющие характерные признаки роста на дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу признаков, указанных в табл. 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину. Бактерии Е. sakazakii обладают альфа-глюкозидазной активностью.

8. Учет результатов

8.1. Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно.

8.2. При получении положительного результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении E. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

При получении отрицательного результата дают заключение об отсутствии E. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

8.3. Учет результатов при количественном определении.

Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий E. sakazakii при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя таблицу, приведенную в Приложении, находят наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий E. sakazakii, соответствующее их содержанию в 1 г (куб. см) продукта.

Для окончательного определения НВЧ бактерий E. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием E. sakazakii. Так, в случае если расчет ведется от посева массы (объема) 100 г (куб. см) (х 3) продукта, количество E. sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (х 3), количество E. sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из таблицы на 10.

Пример: Бактерии E. sakazakii обнаружены в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в одной - при посеве 1 г.

Рисунок не приводится

Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий E. sakazakii из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (см. Приложение). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий E. sakazakii составляет 0,46 КОЕ в 1 г продукта.

Если значение НВЧ по таблице составляет величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие Enterobacter sakazakii проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

10. Нормативные ссылки

10.1. ГОСТ 30519-97 "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae".

10.2. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".

10.3. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований".

10.4. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".

10.5. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

10.6. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".

10.7. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

10.8. СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

10.9. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

Приложение

ТАБЛИЦА ДЛЯ РАСЧЕТА НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА

МИКРООРГАНИЗМОВ