УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
29 октября 2008 г.
Дата введения:
15 декабря 2008 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER SAKAZAKII
В ПРОДУКТАХ ДЛЯ ПИТАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2428-08
1. Разработаны Государственным
учреждением "Научно-исследовательский институт питания" Российской
Академии медицинских наук (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, И.Я.Конь,
Н.Р.Ефимочкина, И.Б.Быкова, С.Ю.Батищева).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией
по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной
службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Руководителем Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29
октября 2008 г.
4. Введены в действие с 15 декабря 2008
г.
5. Введены впервые.
1. Общие положения
и область применения
1.1. Настоящие методические указания
устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Enterobacter
sakazakii - возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста - при
осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также
при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и
инфекций с пищевым путем передачи.
1.2. Методические
указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих
контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов,
в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику
заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть
использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества
и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1.3. Контролю на
наличие бактерий E. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты
прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и
профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на
наличие патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, не были выявлены
облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia,
группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей
грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры.
1.4. Необходимость контроля указанных
групп продукции на наличие E. sakazakii обусловлена регистрацией в последние
годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и
некротизирующего энтероколита у детей 1 года жизни, в первую очередь
недоношенных, новорожденных с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все
случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей,
контаминированных E. sakazakii, в т.ч. при очень низких уровнях возбудителя
(1-10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь E. sakazakii может
попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами,
добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового
продукта.
1.5. Предлагаемый метод
определения бактерий E. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для
детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия
указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии
с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности
и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме
и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов
анализа по двухклассной системе. Настоящие методические указания также
предусматривают определение количества E. sakazakii в пищевых продуктах для
детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ).
1.6. Обнаружение E. sakazakii
в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных
для детей 1 года жизни, или в 300 г сухих молочных смесей или
специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев должно рассматриваться
как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о
высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить
основанием для запрета использования такой продукции с принятием
соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов
детского питания.
2. Сущность метода
2.1. Метод определения бактерий
Enterobacter sakazakii основан на высеве определенных количеств
продукта в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства
Enterobacteriaceae с последующим пересевом на поверхность твердых селективных
сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти
и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с
последующим выделением чистой культуры. Ниже представлена методическая схема определения
E. sakazakii.
Таблица 1
СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ СУХИХ ДЕТСКИХ
СМЕСЕЙ НА НАЛИЧИЕ E. SAKAZAKII
|
Этап
|
Продолжительность
инкубации, ч.
|
Температура,
град. C
|
|
1. Подготовка
реактивов и материалов
|
|
|
|
2. Растворение
навесок в стерильном
фосфатном буфере (ФБР) в соотношении 1:10
(при необходимости определения количества
- навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы
или пробирки с ФБР каждая), смешивание
и инкубация
|
18-24
|
36
|
|
3. Посев
проинкубированной суспензии
в селективный питательный бульон
для выделения бактерий семейства
Enterobacteriaceae и инкубация
|
18-24
|
36
|
|
4. Пересев 0,1 мл
проинкубированного
бульона для выделения Enterobacteriaceae
на поверхность фиолетово-красного желчного
агара с глюкозой (VRBG agar) или агар Эндо
|
18-24
|
36
|
|
5. Отбор 5
подозрительных на E. sakazakii
колоний с поверхности VRBG агара или Эндо,
пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым
экстрактом (TSYEA) и инкубация
|
48-72
|
25
|
|
6. Отбор колоний
с желтым пигментом,
микроскопия по Граму и подтверждение их
видовой принадлежности
|
|
|
|
7. При необходимости
- подсчет наиболее
вероятного числа (НВЧ) по количеству
положительных проб в каждой из засеянных
навесок продукта
|
|
|
2.2. Идентификация чистых культур
проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков,
определяющих принадлежность к виду E. sakazakii. Подтверждение принадлежности к
E. sakazakii производится путем получения развернутых биохимических
характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической
дифференциации энтеробактерий API 20E, Rapid 20E, ID 32E (ф.
"БиоМерье", Франция) и др.
Определение биохимических характеристик,
дифференцирующих E. sakazakii от близкородственных представителей
энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены
в табл. 2.
Таблица 2
БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ENTEROBACTER
SAKAZAKII
|
Тест или
субстрат
|
Реакции
|
|
E. sakazakii
|
E. cloacae
|
P. agglomerans
|
|
Лизиндекарбоксилаза
|
-
|
-
|
-
|
|
Аргининдигидролаза
|
+
|
+
|
-
|
|
Орнитиндекарбоксилаза
|
+
|
+
|
(-)
|
|
Подвижность
|
+
|
+
|
(+)
|
|
Утилизация
цитратов
|
+
|
+
|
+
|
|
Реакция с
метиловым красным
|
-
|
-
|
-
|
|
Реакция
Фогес-Проскауэра
|
+
|
+
|
(+)
|
|
Индол
|
-
|
-
|
(-)
|
|
Глюкоза
|
+
|
+
|
+
|
|
Лактоза
|
+
|
+
|
(+)
|
|
Сахароза
|
+
|
+
|
(+)
|
|
Дульцит
|
-
|
-
|
(-)
|
|
Адонит
|
-
|
(-)
|
-
|
|
Раффиноза
|
(+)
|
+
|
(+)
|
|
D-сорбит
|
-
|
+
|
(+)
|
|
альфа-Метил-D-глюкозид
|
+
|
(+)
|
-
|
|
Мальтоза
|
+
|
+
|
+
|
|
Маннит
|
+
|
+
|
+
|
|
Разжижение
желатины (22 град. C)
|
-
|
-
|
+
|
|
Мукоидный
рост
|
+
|
+
|
+
|
|
Желтый пигмент
при 24 град. C
|
+
|
-
|
(+)
|
Примечания:
"+" - 90-100% штаммов положительные;
"(+)" - 21-89% штаммов положительные;
"-" - 0-9% штаммов положительные;
"(-)" - 10-24% штаммов положительные.
Ведущими дифференцирующими признаками
Enterobacter sakazakii от других представителей вида Enterobacter являются
способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных
средах при оптимальной температуре 25 град. C и отсутствие ферментации
D-сорбита. Для дифференциации E. sakazakii от
сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea
agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест
разжижения желатины.
В качестве дополнительного теста при
идентификации E. sakazakii возможно определение альфа-глюкозидазной активности
на хромогенных средах, содержащих 4-нитрофенил-альфа-d-глюкопиранозид или
5-бромо-4-хлоро-3-индолил-альфа,d-глюкопиранозид.
3. Аппаратура,
материалы, лабораторная посуда,
реактивы и питательные среды
3.1. Аппаратура и
инструментарий
Анализатор
потенциометрический, погрешность
измерений pH +/-
0,01 ГОСТ
19881-74
Шкаф сушильный
стерилизационный ШСС-80П
или других
марок, позволяющий поддерживать
температуру (160
+/- 5) град. C ТУ
64-1-28-70-76
Термостат,
позволяющий поддерживать рабочую
температуру 37
град. C с отклонением от заданной
+/- 1 град.
C
ТУ 64-1-1382-83
Термостат,
позволяющий поддерживать рабочую
температуру 41,5
град. C с отклонением от заданной
+/- 1 град.
C
ТУ 64-1-1382-83
Весы
лабораторные общего назначения 2 и 4
класса точности
с наибольшим пределом
взвешивания 200
г ГОСТ
24104-88
Микроскоп
биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3,
МБР-1, МБР-3,
МБС
ГОСТ 8284-78
Стерилизаторы
паровые медицинские или
аналогичные ГОСТ
19569-89Е
Дистиллятор,
обеспечивающий качество
дистиллированной
воды в соответствии с ГОСТ
6709-72
Гомогенизатор
перистальтического типа "Микс-2",
"Стомайкер"
или других наименований
AES Lab,
Cat. N AESAP 1066
Гомогенизатор
типа "вортекс"
Микропипетки на
200-1000 мкл
BIOHIT, Cat. N 720040
или "Ленпипет"
Облучатель
бактерицидный настенный
ОБН-150 или
других видов ТУ-16-535-84
Холодильник
бытовой электрический
ГОСТ 16317-87
Пинцет
медицинский
ГОСТ 21241-89
Ножницы
медицинские
ГОСТ 21239-89
Скальпель
хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Часы
механические сигнальные
ГОСТ 3145-84
Электроплитка ГОСТ
14919-83
Аппарат
универсальный для встряхивания
жидкости в
колбах и пробирках
(или другая
аппаратура для встряхивания)
ТУ 64-1-2451-78
3.2. Лабораторная
посуда и материалы
Бумага
фильтровальная лабораторная
ГОСТ 12026-76
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Колбы
плоскодонные конические
или круглые разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки
стеклянные
ГОСТ 25336-82
Вата медицинская
гигроскопическая ГОСТ
5556-81
Пипетки
вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см
ГОСТ 29227-91
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла
предметные для микропрепаратов
ГОСТ 6672-75
Спиртовки
лабораторные стеклянные
ГОСТ 23932-90
Термометр
ртутный с диапазоном измерения
от 0 до 100 град.
C (цена деления шкалы 1 град. C) ГОСТ
13646-68
Чашки
биологические (Петри) или одноразовые
из полимерных
материалов
ГОСТ 23932-90
Пакеты
стерильные для гомогенизатора
AES Lab.,
Cat. N AES400/50G
Отраслевой
стандарт для визуальной
оценки мутности
N 10 ГИСК
им. Л.А.Тарасевича
Денситометр для
бактериальных суспензий
типа "Densi-La-Meter"
или "Денсимат"
ф. "Лахема",
"BioMerieux"
Стандарт
Макфарланда N 1, 2, 3
ф. "BioMerieux"
Петля
бактериологическая
3.3. Реактивы и
питательные среды
Агар
микробиологический
ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза,
ч.
ГОСТ 6038-79
D-лактоза,
1-водная
ТУ 6-09-22-98-79
Маннит
D-сорбит
Рамноза
Калия
гидроокись
ГОСТ 24363-80
Калий
фосфорнокислый однозамещенный, ч.
ГОСТ 4198-75
Калий
фосфорнокислый двузамещенный 3-водный
ГОСТ 2493-75
Кислота соляная,
х.ч. ГОСТ
3118-77
Литий хлористый,
ч. или х.ч. или ч.д.а. ГОСТ
4328-77
Масло
иммерсионное для микроскопии
ГОСТ 31739-78
Набор реактивов
для окраски по Граму
Натрий-аммоний
фосфорнокислый
двузамещенный,
4-водный, ч. или х.ч.
ГОСТ 4170-78
Натрия
гидроокись, ч.д.а.
ГОСТ 4328-77
Натрий
лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а.
ГОСТ 22280-75
Натрий хлористый,
ч. или х.ч. или ч.д.а. ГОСТ
4233-77
Пара-диметиламинобензальдегид,
ч. ТУ 6-09-3272-77
Пептон сухой
ферментативный для
бактериологических
целей ГОСТ
13805-76
Спирт этиловый
ректификованный технический
ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый
ректификованный
ГОСТ 5962-67
Феноловый
красный
ГОСТ 5853-51
Фенолфталеин ГОСТ
5850-72
Фуксин
основной ТУ 6-09-4119-75
Хлороформ
технический
ГОСТ 2-15-76-72
Уксусная
кислота
ГОСТ 61-75
Сульфаниловая
кислота
альфа-Нафтол
Цинк
порошкообразный ГОСТ 3640
Желатин сухой
Экстракт
дрожжевой сухой
Тест-штамм
Enterobacter sakazakii, типичный
по
культуральным, морфологическим
и биохимическим
свойствам ГИСК
им. Л.А.Тарасевича
Пептонная вода
забуференная (сухая)
Триптозный
ГРМ-агар и ГРМ-бульон
ФС 42-3377-97
(ГНЦПМ)
Питательный
бульон и питательный агар
ТУ 10-02-02-789-176-94
Триптон-соевый
агар с дрожжевым
экстрактом
(TSYEA)
HiMedia M1214
Триптон-соевый
бульон с дрожжевым
экстрактом
(TSYEB)
HiMedia M1263
Среды Гисса с
глюкозой, лактозой, маннитом,
рамнозой,
дульцитом, адонитом, сахарозой,
сорбитом ФС
(ЦНИИВС
им. И.И.Мечникова
НИИ
питательных сред)
SIM-arap
(сероводород-индол-подвижность)
Difco
Среда Эндо ТУ
9229-072-00419785
Агар желчный фиолетово-красный ТУ 9229-072-00419785
Среда Кесслер с
глюкозой ГОСТ
30519-97
Бульон Мак-Конки с глюкозой ГОСТ 30519-97
Бульон с желчью,
бриллиантовым зеленым
и глюкозой ГОСТ
30519-97
Тест-системы
биохимические для видовой
идентификации
API 20E, Rapid 20E, ID 32E,
для
идентификации Enterobacteriaceae
и других
грамотрицательных палочек
BioMerieux
Набор реактивов
для окраски по Граму
Набор для
постановки оксидазного теста
Примечание. Допускается использование
других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными
характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после
процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.
Питательные среды и биологические
препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат
качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного
производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в
установленном порядке.
4. Подготовка к
анализу
4.1. Приготовление
растворов и реактивов
|
4.1.1.
Пептонно-солевой
раствор
|
По ГОСТ
26669-85
|
|
4.1.2.
Изотонический (0,85%-й
водный) раствор хлорида натрия
|
По ГОСТ
26669-85
|
|
4.1.3.
Приготовление растворов
и реактивов для окраски
препаратов по Граму
|
По ГОСТ 10444.1
или в соответствии
с инструкцией по применению
|
|
4.1.4. Стерильный
фосфатный
буфер с pH 7,2 +/- 0,1
|
KH2PO4 - 0,45 г,
Na2HPO4 - 5,34 г
в 1000 куб. см дистиллированной H2O,
стерилизовать при температуре 121 град. C
в течение 30 мин.
|
4.2. Приготовление
питательных сред
4.2.1. Среды промышленного изготовления,
поименованные в п. 3.3., готовят согласно прописям на этикетке или в
соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.
4.2.2. Питательный агар
с 5% глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 "Консервы.
Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в
микробиологическом анализе".
4.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым
экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.
Состав сред (г/л):
ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый
- 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт -
6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.
Компоненты растворяют в 1000 куб. см
дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и
автоклавируют при 121 град. C в течение 15 мин.
Готовые среды разливают в стерильные
колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не
выше 8 град. C.
4.2.4. Среда для определения подвижности:
20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и
5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной
воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5-7 куб. см и
стерилизуют при 121 град. C в течение 15 мин.
4.2.5. Среды Гисса с углеводами: 10 г
пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 куб. см
дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают
pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование
индикатора бромкрезолового пурпурного, "ВР" и др.), разливают в
пробирки и стерилизуют при 112 град. C в течение 20 мин.
5. Отбор и
подготовка проб к анализу
5.1. Отбор и подготовку проб продукции
производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для
микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и
вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96
"Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания
и их компонентов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96).
Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения
исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать
аналитический образец.
5.2. От продукции в потребительской таре
пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы
или объема потребительской тары, с тем чтобы
количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной
или потребительской таре больших размеров (или неупакованной) пробы отбирают из
разных мест с различной глубины, включая поверхность.
5.3. Для микробиологических анализов
пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы
стерильным инструментом в стерильную посуду.
5.4. Первичный посев исследуемых проб
продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком,
изложенным в МУК 4.2.577-96
"Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания
и их компонентов".
5.5. При отсутствии
роста облигатных патогенов, принадлежащих к родам Salmonella, Shigella,
Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но при обнаружении роста
сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры в нормируемых
навесках исследуемых продуктов, от них отбирают дополнительные пробы (2 навески
по 100 г при первичном посеве 100 г продукта, 2 невески по 125 г при первичном
посеве 50 г, 2 навески по 137,5 г при первичном посеве
25 г) и анализируют в соответствии с процедурой, изложенной в разделе 6.
6. Проведение
анализа
6.1. Пробы продуктов массой 100, 125 или
137,5 г вносят в фосфатный буферный раствор (ФБР) или изотонический раствор (п.
3.3.) в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37
+/- 1) град. C в течение (22 +/- 2) ч.
6.2. При количественном анализе общая
масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (куб. см).
Из подготовленной по п. 5 пробы для
анализа отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (куб. см) каждая.
Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 куб. см ФБР и
перемешивают.
Из четвертой
навески (порции) массой (объемом) 100 г (куб. см) отбирают три навески (порции)
продукта массой 10 г (куб. см) и производят посев в 90 куб. см ФБР,
перемешивают. Из этой же пробы
отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (куб. см) и производят посев
в 9 куб. см ФБР. Для посева (при необходимости - предполагаемом высоком
содержании E. sakazakii в продукте) меньших количеств продукта
- 0,1; 0,01 г - делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г и
вносят по 1 куб. см (х 3) соответствующих разведений в 9 куб. см ФБР.
6.2.1. После термостатирования
проб продукта в среде для первичного накопления 10 куб. см суспензии (1 куб. см
- при первичном засеве 1 г или 1 куб. см) пересевают в 90 куб. см (9 куб. см)
жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по
ГОСТ 30519-97 - среду Кесслера с глюкозой, или глюкозный бульон с бриллиантовым
зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при
температуре (37 +/- 1) град. C в течение (22 +/- 2) ч.
6.2.2. Из посевов после
термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают
пересев штрихом на поверхность чашек Петри с одной из агаризованных
дифференциально-диагностических сред по п. 3.3. Допускается проводить пересев
петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.
Посевы термостатируют при температуре (37
+/- 1) град. C в течение 24 ч.
6.2.3. При отсутствии роста на чашках с
дифференциально-диагностическими средами типа агара Эндо
или агара желчного фиолетово-красного анализ прекращают и дают заключение об
отсутствии E. sakazakii в исследованной пробе.
6.3. При обнаружении на чашках
лактозоположительных колоний дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные
варианты, для чего отбирают по 3-5 колоний каждого типа для их дальнейшего
изучения.
6.4. Отобранные для
исследования 3-5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого
агара с дрожжевым экстрактом по п. 3.3 и термостатируют при температуре 25
град. C в течение 72 ч. В качестве положительного контроля используют
референс-штамм E. sakazakii, типичный по фенотипическим свойствам.
6.5. Культуры, растущие на триптон-соевом
агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают
дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Enterobacter sakazakii.
7. Подтверждение
принадлежности выделенных культур
к Enterobacter sakazakii
7.1. Подтверждение принадлежности
выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической
идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E.
7.2. К бактериям Enterobacter sakazakii
относят культуры, имеющие характерные признаки роста на
дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные
отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу
признаков, указанных в табл. 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит
и не разжижающие желатину. Бактерии Е. sakazakii обладают альфа-глюкозидазной
активностью.
8. Учет результатов
8.1. Результаты оценивают по каждой
исследованной пробе отдельно.
8.2. При получении положительного
результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении E. sakazakii в
исследованной навеске (объеме) продукта.
При получении отрицательного результата
дают заключение об отсутствии E. sakazakii в исследованной навеске (объеме)
продукта.
8.3. Учет результатов при количественном
определении.
Результат оценивают по каждой
исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных
результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс
(объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий E. sakazakii при
пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В
зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов
для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число
(индекс), по которому, используя таблицу, приведенную в Приложении, находят
наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий E. sakazakii, соответствующее их
содержанию в 1 г (куб. см) продукта.
Для окончательного определения НВЧ
бактерий E. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой
выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным
наличием E. sakazakii. Так, в случае если расчет ведется от посева массы
(объема) 100 г (куб. см) (х 3) продукта, количество E. sakazakii в 1 г (куб.
см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы
соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве
первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (х 3), количество E.
sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из
таблицы на 10.
Пример: Бактерии E. sakazakii обнаружены
в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в
одной - при посеве 1 г.
Рисунок не приводится
Результат по числу секторов с
подтвержденным ростом бактерий E. sakazakii из трех выбранных масс записывается
как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (см. Приложение).
Соответственно, наиболее вероятное число бактерий E. sakazakii составляет 0,46
КОЕ в 1 г продукта.
Если значение НВЧ по таблице составляет
величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно
повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная
концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально
выбранном значении.
9. Требования
безопасности
Исследования пищевых продуктов на наличие
Enterobacter sakazakii проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99
"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и
гельминтами".
10. Нормативные
ссылки
10.1. ГОСТ 30519-97 "Продукты
пищевые. Метод выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae".
10.2. ГОСТ Р
51446-99 (ИСО 7218-96) "Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила
микробиологических исследований".
10.3. ГОСТ 26668-85 "Продукты
пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических
исследований".
10.4. ГОСТ 26669-85 "Продукты
пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".
10.5. ГОСТ 26670-91 "Продукты
пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".
10.6. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы.
Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в
микробиологическом анализе".
10.7. СанПиН 2.3.2.1078-01
"Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
10.8. СанПиН 1.2.731-99
"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и
гельминтами".
10.9. МУК 4.2.577-96 "Методы
микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их
компонентов".
Приложение
ТАБЛИЦА ДЛЯ РАСЧЕТА НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА
МИКРООРГАНИЗМОВ
|
Число секторов с
подтвержденным
ростом E. sakazakii (из трех
выбранных значений массы
(объема))
|
НВЧ,
КОЕ/г,
куб. см
|
Действительное
число
микроорганизмов в 1 г (куб. см)
с вероятностью, %
|
|
1,0
|
0,1
|
0,01
|
95
|
99
|
|
от
|
до
|
от
|
до
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
|
0
|
0
|
0
|
< 0,30
|
0,00
|
0,94
|
0,00
|
1,40
|
|
0
|
0
|
1
|
0,30
|
0,01
|
0,95
|
0,00
|
1,40
|
|
0
|
1
|
0
|
0,30
|
0,01
|
1,00
|
0,00
|
1,60
|
|
0
|
1
|
1
|
0,61
|
0,12
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
0
|
2
|
0
|
0,62
|
0,12
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
0
|
3
|
0
|
0,94
|
0,35
|
3,30
|
0,18
|
4,60
|
|
1
|
0
|
0
|
0,36
|
0,02
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
1
|
0
|
1
|
0,72
|
0,12
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
1
|
0
|
2
|
1,10
|
0,40
|
3,50
|
0,20
|
4,60
|
|
1
|
1
|
0
|
0,74
|
0,13
|
2,00
|
0,06
|
2,70
|
|
1
|
1
|
1
|
1,10
|
0,40
|
3,50
|
0,20
|
4,60
|
|
1
|
2
|
0
|
1,10
|
0,40
|
3,50
|
0,20
|
4,60
|
|
1
|
2
|
1
|
1,50
|
0,50
|
3,80
|
0,20
|
5,20
|
|
1
|
3
|
0
|
1,60
|
0,50
|
3,80
|
0,20
|
5,20
|
|
2
|
0
|
0
|
0,92
|
0,15
|
3,50
|
0,07
|
4,60
|
|
2
|
0
|
1
|
1,40
|
0,40
|
3,50
|
0,20
|
4,60
|
|
2
|
0
|
2
|
2,00
|
0,50
|
3,80
|
0,20
|
5,20
|
|
2
|
1
|
0
|
1,50
|
0,40
|
3,80
|
0,20
|
5,20
|
|
2
|
1
|
1
|
2,00
|
0,50
|
3,80
|
0,20
|
5,20
|
|
2
|
1
|
1
|
2,00
|
0,50
|
3,80
|
0,20
|
5,20
|
|
2
|
1
|
2
|
2,70
|
0,90
|
9,40
|
0,50
|
14,20
|
|
2
|
2
|
0
|
2,10
|
0,50
|
4,00
|
0,20
|
5,60
|
|
2
|
2
|
1
|
2,80
|
0,90
|
9,40
|
0,50
|
14,20
|
|
2
|
2
|
2
|
3,50
|
0,90
|
9,40
|
0,50
|
14,20
|
|
2
|
3
|
0
|
2,90
|
0,90
|
9,40
|
0,50
|
14,20
|
|
2
|
3
|
1
|
3,60
|
0,90
|
9,40
|
0,50
|
14,20
|
|
3
|
0
|
0
|
2,30
|
0,50
|
9,40
|
0,30
|
14,20
|
|
3
|
0
|
1
|
3,80
|
0,90
|
10,40
|
0,50
|
15,70
|
|
3
|
0
|
2
|
6,40
|
1,60
|
18,10
|
1,00
|
25,00
|
|
3
|
1
|
0
|
4,30
|
0,90
|
18,10
|
0,50
|
25,00
|
|
3
|
1
|
1
|
7,50
|
1,70
|
19,90
|
1,10
|
27,00
|
|
3
|
1
|
2
|
12,00
|
3,00
|
36,00
|
2,00
|
44,00
|
|
3
|
1
|
3
|
16,00
|
3,00
|
38,00
|
2,00
|
52,00
|
|
3
|
2
|
0
|
9,30
|
1,80
|
36,00
|
1,20
|
43,00
|
|
3
|
2
|
1
|
15,00
|
3,00
|
38,00
|
2,00
|
52,00
|
|
3
|
2
|
2
|
21,00
|
3,00
|
40,00
|
2,00
|
56,00
|
|
3
|
2
|
3
|
29,00
|
9,00
|
99,00
|
5,00
|
152,00
|
|
3
|
3
|
0
|
24,00
|
4,00
|
99,00
|
5,00
|
152,00
|
|
3
|
3
|
1
|
46,00
|
9,00
|
198,00
|
5,00
|
283,00
|
|
3
|
3
|
2
|
110,00
|
20,00
|
400,00
|
10,00
|
570,00
|
|
3
|
3
|
3
|
> 110,00
|
|
|
|
|