УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

29 июля 2008 г.

 

Дата введения -

1 сентября 2008 года

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ

СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2413-08

 

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора; ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора; ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора; ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора; ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора; ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора; ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора; ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. N 2).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5. С введением в действие данных Методических указаний при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", утвержденные 01.09.86 начальником Главного управления ветеринарии Госагропромкомитета СССР и начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР, применению не подлежат.

 

1. Область применения

 

1.1. Настоящие Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций.

1.2. В Методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

 

Список сокращений

 

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной

           вирусологии и микробиологии;

ГИСК     - Государственный институт стандартизации и контроля;

ГКИ      - Государственный контрольный институт;

ДДМ      - диско-диффузионный метод;

ДНК      - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА      - иммуноферментный анализ;

кДа      - килодальтон;

ЛФ       - летальный фактор;

МПА      - мясопептонный агар;

МПБ      - мясопептонный бульон;

МПК      - минимальная подавляющая концентрация;

МФА      - метод флуоресцирующих антител;

ОФ       - отечный фактор;

ПА       - протективный антиген;

ПЦР      - полимеразная цепная реакция;

РНГА     - реакция непрямой гемагглютинации;

РТНГА    - реакция торможения непрямой гемагглютинации;

"СОПЭК"  - среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и

           капсулы;

ЭДТА     - этилендиаминтетераацетата динатриевая соль;

DCL      - абсолютная летальная доза;

LD       - половинная летальная доза;

  50

MLVA     - метод анализа областей генома с вариабельным числом тандемных

           повторов.

 

2. Нормативные и методические ссылки

 

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03".

2.2. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".

2.3. "Сибирская язва. СП 3.1.089-96, ВП 13.3.1320-96".

2.4. Практическое руководство "Специфическая индикация патогенных биологических агентов", 2006.

2.5. Методические указания "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03".

2.6. Методические указания "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04".

2.7. Методические указания "Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034-01".

2.8. Методические рекомендации по использованию этилового спирта с 3% перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы, 1984.

2.9. Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов, 1984.

2.10. Методические рекомендации "Использование 0,05-0,1%-ного раствора Твина-80 как разводящей жидкости для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба", 1986.

2.11. Методические рекомендации "Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба", 1989.

2.12. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения, Госкомсанэпиднадзор РФ, 1995.

2.13. Методические рекомендации "Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики". МЗ РФ, ЦНИИЭ, 2004.

2.14. Методические рекомендации "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. МР 0100/3556-04-34", 2005.

2.15. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам, 1990.

 

3. Общие положения

 

Сибирская язва (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями.

В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов; непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля.

В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение.

Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

 

3.1. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

 

Возбудитель сибирской язвы - B. anthracis, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Bacillaceae, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные B. cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб B. weichenstephanensis.

Морфология B. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бескапсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор.

В мазках из культур, выросших на питательных средах, палочки (размеры 1-1,5х6-8-10 мкм) расположены длинными цепочками, концы микробов в окрашенных препаратах обрублены и цепочка напоминает бамбуковую трость с коленчатыми сочленениями (Прилож. 7, рис. 1 - не приводится). В мазках из патологического материала палочки расположены поодиночке, попарно или короткими цепочками, окружены хорошо выраженной капсулой, зачастую общей для группы микробов (Прилож. 7, рис. 2 - не приводится).

Спорообразование. При выращивании возбудителя на питательных средах и в условиях окружающей среды при свободном доступе кислорода воздуха, определенной влажности и температуре от 12,0 до 42,5 град. С образуются споры овальной формы размером 0,8-1х1,2-1,5 мкм. В каждой вегетативной клетке (спорангии) образуется только одна спора, располагающаяся центрально, ее диаметр не превышает ширину тела микробной палочки (Прилож. 7, рис. 3 - не приводится).

Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, pH среды, температуры выращивания, влажности и др.

При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 град. С) и других факторов.

Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34-37 град. С, оптимальное значение pH 7,2-7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36 +/- 1) град. С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7х10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (Прилож. 7, рис. 4 - не приводится).

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-ной пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (Прилож. 7, рис. 5 - не приводится).

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью, и при посеве уколом в столбик 10-12%-ного мясопептонного желатина и выращивании при 22 град. С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3-5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3-5% дефибринированной крови барана через 20-24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12-18 ч при 37 град. С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не свертывается даже при 5-6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6-10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу).

Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительно к пенициллину и при выращивании на МПА или МПБ в присутствии 0,5-0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образует цепочки из шарообразных клеток - "жемчужное ожерелье" (Прилож. 7, рис. 6 - не приводится).

До 95% штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами "Гамма", "К" и Fah-ВНИИВВиМ (Прилож. 7, рис. 7 - не приводится).

Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков - цефалоспоринам I поколения, тетрациклинам, рифампицинам, аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалоспоринам II-IV поколения устойчив.

Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных.

Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях.

Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма.

Типичные вирулентные штаммы B. anthracis образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1%-ном бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5-50% углекислоты, или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40% инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60% раствора Хенкса. На 1%-ном бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (Прилож. 7, рис. 8 - не приводится).

Экзотоксин играет ведущую роль в патогенезе сибиреязвенной инфекции и формировании специфического иммунитета. Сибиреязвенный экзотоксин относится к бинарным двухкомпонентным белковым токсинам AB-типа и обладает двумя разными биологическими активностями. Компонентами токсина являются ОФ, ПА и ЛФ. Это белки с молекулярными массами 89, 83 и 85 кДа. В настоящее время можно встретить сообщения о двух токсинах - отечном (ОФ + ПА) и летальном (ЛФ + ПА), в которых эффекторную функцию выполняют ОФ и ЛФ (A-субъединицы), а акцепторную и интернализирующую функции - ПА (B-субъединица).

Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токсинообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами pXO1 и pXO2. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты.

В природе наряду с "классическими" диплазмидными штаммами с меньшей частотой встречаются атипичные моно- и бесплазмидные варианты возбудителя.

 

3.2. Исследование на сибирскую язву

 

Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку основных и дополнительных тестов идентификации, использование МФА для обнаружения антигенов и антител к ним, постановку ПЦР, биопробы и реакции преципитации. У человека и свиней в случае невозможности установить диагноз вышеперечисленными методами обязательна постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном.

 

4. Материал для исследования, взятие, пересылка материала

и подготовка проб для исследования

 

Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности", МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности".

 

4.1. Материал для исследования

 

а) от больных или подозрительных на заболевание людей в зависимости от формы заболевания - содержимое везикул, отделяемое карбункула или язвы, струпья, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, моча, испражнения, экссудаты;

б) трупный материал - кровь, экссудаты, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов и др.);

в) материал от животных;

г) продовольственное сырье и продукты животного происхождения;

д) объекты окружающей среды - почва, трава, фураж, подстилка, вода и т.д.

Забор всех видов материала осуществляется в стерильную стеклянную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб. Иммунофлуоресцентным, серологическим и бактериологическим методами исследуется соответствующий материал из общей пробы.

 

4.2. Взятие материала от животных

 

4.2.1. Для бактериологического исследования

В случае падежа животного в лабораторию направляют ухо и мазок, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно ухо туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного или в ходе вынужденного убоя, все манипуляции по вскрытию прекращают и на исследование направляют кровь, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения), костный мозг (из грудины или канала бедренной кости). Материалы от трупа необходимо брать и исследовать как можно раньше, так как из-за развития посторонней микрофлоры трудно выделить чистую культуру возбудителя сибирской язвы. От трупов свиней в обязательном порядке отбирают заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани.

У животных с подозрением на заболевание или больных берут на исследование кровь с помощью шприца из яремной вены или из вены уха, а у свиней - из вены хвоста. В отдельных случаях у животных берут на исследования пробы каловых масс.

4.2.2. Для исследования методом ПЦР

Микробиоптат/микроаутоптат (пунктат) помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-1,7 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками, содержащие 0,1-0,2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида или транспортной среды N 1 (Прилож., 1.8).

Макробиоптат/макроаутоптат (кусочки тканей массой 0,1-1,0 г) помещают в контейнер с 0,9%-ным раствором натрия хлорида или транспортной средой N 2 (Прилож., 1.9).

 

4.3. Взятие материала от человека

 

4.3.1. Для бактериологического исследования

Забор материала от больных людей должен производиться до начала специфического лечения.

Необходимо осторожно обработать спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула. Содержимое везикулы отсасывают стерильным шприцем или стерильной тонко оттянутой обломанной пастеровской пипеткой. В пипетку обычно набирается небольшое количество опалесцирующей желтоватой жидкости в объеме, достаточном для посева на агаровую среду и для приготовления мазка. Затем иглу или кончик пипетки помещают в пробирку с питательным бульоном. Отделяемое язвы снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Фрагменты отторгнутого струпа снимают влажным тампоном или пинцетом.

При всех формах заболевания из крови, взятой на анализ, возбудитель сибирской язвы можно выделить уже при первом повышении температуры тела. Кровь берут из локтевой вены стерильным шприцем в объеме 3-5 мл (с учетом необходимости проведения бактериологических, серологических исследований и ПЦР). Сразу же, непосредственно у постели больного, по 0,1-0,2 мл крови засевают на питательные среды (агар и бульон Хоттингера, pH 7,2-7,5). Одновременно на предметных стеклах делают 2-3 тонких мазка, а остатки крови оставляют для получения сыворотки. Если невозможно сразу же исследовать кровь, ее из шприца переносят в стеклянную посуду (бактериологические пробирки).

Мокроту и испражнения собирают в стерильную посуду. Для высева на питательные среды отбирают слизь с примесью крови.

При висцеральных формах сибирской язвы и менингите исследуют спинномозговую жидкость, которую отбирают после пункции поясничной, субокципитальной области или мозговых желудочков в количестве 0,5 мл в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5-1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой. При подозрении на ингаляционное заражение исследуют также мазки из полости носа. Их берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5-1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой с 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Погрузив рабочую часть зонда в раствор натрия хлорида, вращают зонд в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

4.3.2. Для исследования методом ПЦР

Забор крови проводят из локтевой вены в объеме 3-5 мл. Кровь аккуратно (без образования пены) переносят в стерильную пробирку, содержащую 6%-ный раствор ЭДТА в отношении 1:20 к объему крови. Используют одноразовые шприцы, иглы и посуду.

Содержимое везикул, карбункулов в объеме 0,1-0,3 мл и фрагменты струпьев массой 10-100 мг помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-1,7 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками, содержащие 0,1-0,2 мл транспортной среды N 1 (Прилож., 1.8). Спинномозговую жидкость после пункции одноразовой пункционной иглой отбирают в количестве 0,5 мл в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5-1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой.

Мазки из полости носа берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах, как и для бактериологического исследования, с той разницей, что тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5-1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой с транспортной средой N 2 (Прилож., 1.9).

Транспортирование биологического материала для исследования методом ПЦР при отсутствии транспортной среды осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 град. С. Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

 

4.4. Взятие материала из сырья животного происхождения

и объектов окружающей среды

 

Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи, для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта.

4.4.1. Для бактериологического исследования

4.4.1.1. Мясо и мясные продукты

Из материала, доставленного на исследование, отбирают образцы весом 10-30 г, из мяса - участки с лимфоидной тканью или кровоизлияниями.

4.4.1.2. Шерсть

Шерсть для исследования отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

4.4.1.3. Кожа и кожсырье

Берут кусочки кожи размером 3 х 3 см с периферических незагнивших и незаплесневевших участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.

4.4.1.4. Почва

При отборе проб почвы следует руководствоваться "Методическими рекомендациями по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов" (М., 1984). Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом при заборе проб с большой территории обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб почвенным буром. Перед взятием почвы на территории скотомогильника верхний ее слой снимают на 2-3 см и пробы берут на глубине до 1,5-2,0 м через каждые 25 см не менее 200 г в пробе. Особое внимание обращают на костные и другие животные остатки, которые также отбираются для исследования. Пробы упаковываются в том же порядке. Каждую пробу весом около 100-200 г помещают в мешочек из плотной ткани с завязками или в лабораторную посуду (широкогорлый флакон, банку), закрытую такой же тканью. Нельзя помещать пробы почвы в полиэтиленовые мешочки или в плотно закрытую посуду, так как в этих условиях происходит бурное развитие актиномицетов, губительно действующих на возбудитель сибирской язвы. Вынутую из глубины и не использованную для проб почву с целью обеззараживания смешивают с сухой хлорной известью, содержащей 25% активного хлора, в соотношении 1 часть хлорной извести на 3 части почвы, слегка увлажняют и сбрасывают в шурф. Место отбора проб дезинфицируют раствором хлорной извести, содержащей 5% активного хлора, инструменты - огнем паяльной лампы.

4.4.1.5. Вода

Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10-15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют так же, как пробы почвы.

4.4.1.6. Смывы с объектов внешней среды

Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя с помощью стерильного тампона, смоченного стерильной дистиллированной водой. Площадь смыва одним тампоном около 100 кв. см. Затем тампоны помещают в пробирки, заливают стерильной дистиллированной водой (15 мл) и закрывают пробкой.

4.4.1.7. Корма

Концентрированные корма (зерно, отруби, комбикорм) отбирают в зависимости от условий хранения. При наличии незатаренных кормов первичные пробы отбирают из расчета 1 проба не менее 400 г на 4 кв. м поверхности, но не менее 5 проб от каждого закрома, партии. Первичные пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев корма равномерно по всей площади. При наличии затаренных кормов отбор проводят от каждой упаковочной единицы. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы. Пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды при помощи ножниц и пинцета из расчета 1 проба (40 г) на 4 кв. м площади скирды. Зеленую массу отбирают как грубые корма. Корнеплоды в зависимости от величины отбирают из расчета 1-3 штуки на 4 кв. м площади бурта, отсека. С отобранных корнеплодов скальпелем в местах, где имеются остатки земли, срезают поверхностный слой, который используют для исследования.

В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных первичных проб данной партии, емкости и т.п. Масса средней пробы должна быть не менее 500 г.

4.4.1.8. Воздух

Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов, снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого воздуха должен составлять не менее 3-5 куб. м.

4.4.2. Для исследования методом ПЦР

Для исследования методом ПЦР отбирают пробы из объектов окружающей среды, пищевых продуктов (мясо и продукты животного происхождения), сухих и сочных кормов, подстилки, шкур, шерсти, почвы, воды, смывов с поверхностей. Отбор проб осуществляют так же, как и для бактериологических исследований.

 

4.5. Направление материала на исследование

 

Транспортирование и хранение биологического материала для исследования методом ПЦР должны осуществляться с соблюдением "холодовой цепи": образцы цельной крови - при температуре 2-8 град. С - в течение 1 сут.; образцы плазмы и сыворотки крови - при температуре 2-8 град. С - в течение 5 сут., при температуре -70 град. С - длительно.

Образцы остальных видов биологических материалов - при температуре 2-8 град. С - в течение 1 сут., при температуре -20 град. С - в течение 1 недели, при температуре -70 град. С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Патологический материал для исследования помещают в стерильную посуду (пробирки, банки или другую лабораторную посуду). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью "мазок не фиксирован". В направлении к материалу от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве, достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись "верх, осторожно". Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте.

В сопроводительной к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала. Для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительной прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы.

 

4.6. Подготовка проб к бактериологическому исследованию

 

Кусочки проб мяса, органов и тканей от трупов помещают в ступку, измельчают ножницами или пестиком, затем заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:10, суспензию через марлевый тампон набирают в шприц или пипетку и переносят в пробирку или колбочку.

Воду с илистыми частицами фильтруют через 3 слоя марли. Чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры (N 3) или осадить центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 15 мин. Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем (или фильтры измельчают стерильными ножницами), затем заливают 1-2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Осадок после центрифугирования также ресуспендируют в 1-2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Полученную микробную взвесь используют для исследования. Отфильтрованную воду обеззараживают добавлением сухой хлорной извести из расчета 200 г на 1 л.

Тампоны, которыми делают смывы с объектов окружающей среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют.

Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают. От каждой пробы берут 90-100 г почвы, помещают в колбу, заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида или 0,5% пирофосфата натрия из расчета получения 15-20 мл суспензии. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5-10 мин., дают отстояться 3-5 мин. и надосадочную жидкость переносят в пробирку для исследования.

Для повышения эффективности выявления спор B. anthracis целесообразно проводить двукратную обработку образцов почвы диспергирующей жидкостью с 0,5% пирофосфата натрия. Для этого навеску почвы помещают в стерильный стеклянный или пластиковый флакон и заливают диспергирующей жидкостью из расчета получения 15-20 мл суспензии. Суспензию тщательно перемешивают вращательными круговыми движениями в течение 5-10 мин., дают отстояться 3-5 мин., надосадочную жидкость аккуратно переливают в стерильный пластиковый или стеклянный центрифужный стакан. К образцу почвы вновь добавляют диспергирующую жидкость в половинном объеме и повторяют процедуру элюции. Надосадочные жидкости после первой и второй элюций объединяют в одном центрифужном стакане и центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 15 мин. удаляют механические примеси. Надосадок переносят в стерильный центрифужный стакан и микробную взвесь концентрируют центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 15 мин. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок ресуспендируют в 1 мл стерильного 0,9%-ного раствора натрия хлорида и используют для дальнейшего исследования. Процедуру центрифугирования проводят в отдельных боксовых помещениях или в боксах биологической безопасности III класса ESCO Airstream Class III, либо их аналогах производства других фирм, оборудованных электрическими розетками и УФ-лампами.

Различные порошкообразные вещества, в том числе пищевые продукты и корма, обрабатывают аналогично почве, используя в дальнейшем надосадочную жидкость или раствор в случае растворения вещества.

Для проб из шкур кусочки массой в 1 г помещают в фарфоровую ступку и заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида из расчета 1:10. Кусочки измельчают ножницами и оставляют при 20 град. С на 2-3 ч для размягчения материала. После этого пробы хорошо растирают пестиком в той же жидкости до получения волокнистой мезги, мезгу удаляют, предварительно отжав ее пестиком на внутренней боковой поверхности ступки.

От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5-10 мин. Для освобождения от грубых частиц взвесь можно профильтровать через 2-3 слоя марли.

Для избавления от посторонней микрофлоры подготовленные по описанной выше процедуре пробы из объектов внешней среды, шерсти и кожи, пищевых продуктов делят на две части, одну из которых подвергают термической обработке на водяной бане при 80 град. С в течение 20 мин. Пробы от больного человека и животного, из патологического материала и мяса животных, где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.

 

4.7. Предварительная обработка проб для исследования

методом ПЦР

 

Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин. до полного образования сгустка. После этого сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. Затем сыворотку в объеме 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Микроаутоптаты, сыворотка, содержимое везикул, отделяемое язв, фрагменты отторгнутого струпа, мазки из полости носа и спинномозговая жидкость не требуют предварительной обработки. Макроаутоптаты массой 0,1-1 г помещают в стерильную фарфоровую ступку, добавляют стерильный 0,9%-ный раствор хлорида натрия в соотношении 1:10, измельчают стерильными ножницами с последующим растиранием пестиком. Полученную 10%-ную суспензию центрифугируют или через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость (0,1-0,2 мл) стерильным наконечником с аэрозольным барьером в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-2,0 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками.

Воду, смывы с объектов внешней среды, пробы почвы, пищевых продуктов или кормов, шкур, шерсти предварительно обрабатывают так же, как и для бактериологического исследования, отбирая для исследования методом ПЦР 0,1-0,2 мл водной фазы образцов.

 

5. Порядок проведения исследования

 

Все работы по проведению исследования материала, подозрительного на наличие возбудителя сибирской язвы, проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

Схема проведения анализа представлена на рис. 9 (Прилож. 7).

Исследования на сибирскую язву можно разделить на два этапа:

1) обнаружение возбудителя или его компонентов (ДНК, антигенов) в организме больных людей, животных, секционном материале или объектах окружающей среды, с которыми имели контакт заболевшие и которые могли быть источником инфицирования;

2) выделение и идентификация чистой культуры возбудителя с последующим изучением ее свойств.

При исследовании патологического материала от людей и животных готовят мазки из нативных проб, окрашивают их по Граму и люминесцирующими иммуноглобулинами, засевают на плотные и жидкие питательные среды, заражают лабораторных животных и проводят ПЦР-анализ.

При исследовании методом ПЦР материала, в котором предполагается наличие возбудителя сибирской язвы в виде спор, проводится их предварительная герминация с целью последующего обеззараживания и выделения ДНК.

Для анализа проб кожи, шкуры и шерсти к уже указанным методам добавляется реакция преципитации и исключается бактериоскопия и МФА.

Подготовленные для исследования пробы делятся на две части, одну из которых прогревают при 80 град. С в течение 20 мин. Из непрогретой и прогретой частей материала проводят высев на плотные и жидкие питательные среды, заражают биопробных животных и проводят ПЦР-анализ. Исследование образцов из объектов окружающей среды осуществляют аналогично без использования реакции преципитации.

Загнивший патологический материал исследуют с помощью реакции преципитации и ПЦР.

В лечебных учреждениях, куда поступает больной с подозрением на сибирскую язву, производится забор материала, который направляется в лаборатории особо опасных инфекций Центров гигиены и эпидемиологии, в противочумные учреждения. В лечебных учреждениях больным с подозрением на сибирскую язву также производят постановку кожной аллергической пробы с антраксином.

В лабораториях особо опасных инфекций Центров гигиены и эпидемиологии, в противочумных учреждениях проводят специфическую индикацию, выделение культур и их идентификацию основными методами, используя при наличии возможностей дополнительные методы. Материал от животных (трупов) исследуют всеми методами в ветеринарных лабораториях, специализированных центрах и ветеринарных НИИ.

Выделенные в лабораториях учреждений Федеральной службы культуры B. anthracis после идентификации вместе с паспортами направляют в вышестоящие учреждения в соответствии с установленным действующими документами порядком.

Культуры, выделенные в учреждениях ветеринарного профиля, направляются для окончательной идентификации во Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (г. Покров).

Алгоритмы действий получателей материала, в котором предполагается наличие порошка, содержащего споры возбудителя сибирской язвы и других патогенных биологических агентов (подозрительных почтовых отправлений), а также специалистов, участвующих в проведении противоэпидемических мероприятий и лабораторных исследований, определены методическими рекомендациями МР 0100/3556-04-34 "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ".

 

5.1. Бактериоскопия

 

5.1.1. Световая микроскопия

Из поступившего патологического материала (от людей и животных) готовят несколько мазков, которые подсушивают на воздухе, фиксируют в спирте с добавлением 3% перекиси водорода не более 30 мин. (Прилож., 2.1), после этого окрашивают по Граму и на капсулу одним из методов (по Ребигеру, Михину, Романовскому-Гимзе). В окрашенных мазках из патологического материала сибиреязвенный микроб представляет собой грамположительные палочки, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях (чаще в мазках от человека или свиней) форма возбудителя сибирской язвы может быть нехарактерной (короткие, толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки с вздутием посередине или на конце, возможно наличие "теней" микробов).

Для обнаружения капсул лучшей краской является раствор Ребигера (Прилож., 2.2). На всю поверхность фиксированного мазка пипеткой наносят раствор Ребигера и выдерживают 30-60 сек., затем промывают водой и высушивают. В мазках из свежего патологического материала капсула вокруг микроба окрашивается в розовый или красно-фиолетовый цвет, тело микробной клетки - в темно-фиолетовый. В мазках из крови и спинномозговой жидкости палочки с капсулой увеличены, края микроба закруглены.

При окраске мазков из несвежего патологического материала микробы могут быть также несколько увеличены, концы закруглены, морфологическая стройность бацилл нарушена, они как бы "изъедены", иногда остаются "тени", а от капсулы могут оставаться одни обрывки, которые окрашиваются очень слабо.

Для обнаружения спор в некоторых образцах внешней среды после фиксации мазки окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нильсену (Прилож., 2.3). После фиксации мазка на стекло кладут полоску фильтровальной бумажки и на нее наливают карболовый фуксин Циля. Мазок с краской подогревают на пламени спиртовки до появления паров (но не до кипения) и краску оставляют на препарате без подогревания еще на 2-3 мин. Бумажку удаляют пинцетом, краску сливают, препарат промывают водой. Затем обесцвечивают 5%-ной серной кислотой до желтоватого оттенка (в течение 3-5 с). Тщательно отмывают препарат водой, ополаскивают 5-10 с 96 град.-ным спиртом, а потом - водой. Докрашивают мазок метиленовой синью Леффлера 2-3 мин., смывают водой и просушивают. Препарат просматривают в микроскопе с иммерсионной системой. В мазках наблюдают палочки синего цвета. Споры в зависимости от степени их жизнеспособности могут окрашиваться следующим образом: 1) розовые с более интенсивной окраской по периферии - жизнеспособные; 2) равномерно окрашенные в красный цвет - слабо жизнеспособные; 3) синие - нежизнеспособные.

По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

5.1.2. Люминесцентная микроскопия - МФА

Для люминесцентной микроскопии делают мазки-отпечатки из экссудата брюшной полости и органов биопробных животных, мазки-отпечатки из отечной жидкости и внутренних органов людей и животных, мазки из подозрительных колоний, выросших из посевов проб на чашках с питательными средами. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин. На высохшие фиксированные мазки наносят в рабочих разведениях, указанных на этикетке, диагностические сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные соматические иммуноглобулины. В исходных пробах могут быть обнаружены сибиреязвенные микробы в вегетативной или споровой форме. Мазки из смывов, суспензий, вытяжек из материалов, подозрительных на высокую контаминацию возбудителем сибирской язвы, обрабатывают диагностическими люминесцирующими адсорбированными антиспоровыми иммуноглобулинами.

В случае приготовления мазков непосредственно из нативного материала их окрашивают для увеличения контрастности смесью диагностических иммуноглобулинов и бычьего альбумина, меченого родамином. Для этого готовят отдельно разведения иммуноглобулинов и альбумина в 2 раза меньшие, чем указано на этикетках, смешивают их в соотношении 1:1 и наносят на мазки. Например, рабочее разведение люминесцирующих антиспоровых иммуноглобулинов (1) составляет 1:16, а альбумина (2) - 1:8. Смесь составляют из разведения (1) 1:8 и (2) 1:4. Дальнейшую обработку окрашенных таким образом мазков проводят аналогично мазкам, окрашенным только люминесцирующими иммуноглобулинами.

Мазки с нанесенными на них люминесцирующими иммуноглобулинами помещают во влажную камеру (чашку Петри или эксикатор с увлажненной 0,9%-ным раствором натрия хлорида или дистиллированной водой фильтровальной бумагой или комочком ваты), выдерживают для окрашивания при 37 град. С в течение 20 мин. После этого их тщательно промывают два раза по 10 мин. в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, затем в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Препараты покрывают покровными стеклами или просматривают ex tempore без покровных стекол. Мазки микроскопируют в люминесцентном микроскопе с системой подобранных светофильтров и иммерсионным объективом. При этом необходимо пользоваться нефлуоресцирующим иммерсионным маслом. В случае его отсутствия применяют смесь, содержащую 1 часть 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 9 частей химически чистого глицерина. Споры и вегетативные клетки сибиреязвенного микроба, окрашенные люминесцирующими иммуноглобулинами, дают яркое свечение периферии клеток, имеющих характерную для данного вида морфологию. Такое свечение называется специфическим, в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным неярким свечением всей поверхности клеток. Для учета результатов используется арбитражная система оценки по интенсивности свечения и количеству специфически светящихся клеток:

         +

    -   4    -   большое   количество   специфически   светящихся   клеток,

расположенных   длинными   цепочками   (вегетативная  форма),  очень  яркая

флуоресценция   по   периферии   споры   или   вегетативной  клетки,  четко

контрастирующая с темным телом клетки;

        +

    -  3   -  яркая  флуоресценция  периферии  клетки,  клетки  расположены

отдельными группами (цепочками) и единично;

        +        +

    -  2   или  1  - слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с

ее телом.

                                               +    +

    Свечение  спор  и  вегетативных клеток на 4  и 3  позволяет подозревать

наличие  в исследуемом материале возбудителя сибирской язвы и может служить

основанием для выдачи предварительного положительного ответа.

Необходимо учитывать, что специфичность данного метода составляет не более 70% ввиду наличия перекрестно-реагирующих антигенов у представителей группы Bacillus cereus.

 

5.2. Посев на питательные среды, бактериологический метод

 

5.2.1. Подготовленный для исследования материал ("Подготовка проб к бактериологическому исследованию") засевают на чашки Петри с МПА, агаром Хоттингера (pH 7,2), селективную дифференциально-диагностическую среду с 0,01% натрия фенолфталеинфосфата (Прилож., 1.1) и пробирку с МПБ. Для засева одной пробы желательно использовать не менее 5 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Посев необходимо производить с помощью шпателя, предварительно нанося на поверхность агара 1-2 капли (0,1 мл) исследуемого материала. Если материал значительно загрязнен посторонней микрофлорой (почва, корма, смывы с поверхностей и пр.), делают посевы методом истощения, распределяя материал шпателем по поверхности агара с переносом на 2-3 чашки. При исследовании материала, слабо загрязненного посторонней микрофлорой (кровь, пунктаты из карбункула, органы биопробных животных), посев можно проводить петлей без истощения, используя при этом МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и МПБ. Посевы помещают в термостат при (36 +/- 1) град. С на 18-20 ч и при отсутствии роста выдерживают при той же температуре 48 ч.

5.2.2. После суточного роста сибиреязвенного микроба МПБ остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок в виде "комочка ваты". При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается с трудом на мелкие хлопья. В отдельных случаях в МПБ появляется диффузный рост культуры (легкое помутнение), при встряхивании образуются муаровые волны, на поверхности бульона может наблюдаться рост в виде пристеночного кольца.

Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках из бульонной культуры обнаруживают типичные цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек, из бульонной культуры с диффузным ростом - отдельные или парно расположенные палочки. Для получения чистой культуры из бульона делают высевы на плотные питательные среды петлей для получения изолированных колоний.

5.2.3. На следующий день плотные питательные среды просматривают визуально и под микроскопом при малом увеличении.

Кроме колоний сибиреязвенного микроба, на средах может наблюдаться рост спорообразующих сапрофитов, морфологически трудно отличимых от B. anthracis. Возбудитель сибирской язвы образует плоские матово-серые шероховатые (R-форма) колонии. Центр их иногда затемнен, периферия бахромчатая с локонообразными отростками. Встречаются колонии с менее выраженной шероховатостью и без отростков, которые также подлежат дальнейшей идентификации. Колонии B. anthracis трудно снимаются петлей с поверхности агара, в то время как колонии близкородственных сапрофитов снимаются легко. Для выделения чистой культуры с питательного агара отбирают не менее 10 шероховатых колоний, при отсутствии такого количества - все шероховатые колонии.

Примечание: при оценке морфологии колоний следует учитывать существование редких вариантов сибиреязвенного микроба II типа, формирующих слизистые колонии в SM-форме на обычных питательных средах.

 

5.2.4. Посевы на селективной дифференциально-диагностической среде с фенолфталеинфосфатом натрия перед просмотром обрабатывают парами аммиака. Для этого в отдельную крышку от чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают на нее 1-2 мл аммиака водного (29%-ного, концентрированного). Затем чашку с посевами (агаром вверх) без крышки помещают на несколько секунд (пока не порозовеют колонии сапрофитов) в крышку с аммиаком. Таким образом обрабатывают все посевы. В силу того, что сибиреязвенный микроб не образует или продуцирует фосфатазу слабо, его колонии, как правило, не изменяют своего цвета. Колонии спорообразующих сапрофитов, в том числе и B. cereus, под действием паров аммиака приобретают розовый или красный цвет. С дифференциально-диагностической среды для выделения чистой культуры отбирают визуально и с помощью микроскопа при малом увеличении все колонии, не изменившие своего цвета после обработки парами аммиака или слабо порозовевшие.

    5.2.5.  Из  всех  отобранных  колоний  делают  мазки  на двух или более

предметных  стеклах.  Мазки  фиксируют  и  окрашивают  двумя способами - по

Ребигеру  (или  по  Граму)  и  сибиреязвенной  люминесцирующей соматической

сывороткой.  При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного

микроба  морфологию  (длинные  нити,  концы палочек обрублены), при окраске

                                                              +      +

люминесцирующими  сыворотками  -  специфическое  свечение на 4  или 3 . Для

идентификации  отбирают  только колонии чистой культуры, которые состоят из

характерных для сибиреязвенного микроба палочек. Их отсевают на секторы МПА

или  агара Хоттингера. Материал из всех других отобранных колоний рассевают

петлей  на отдельных чашках Петри с МПА или агаром Хоттингера для получения

изолированных колоний.

На этом этапе исследования для получения чистой культуры сибиреязвенного микроба важно проводить рассев на неселективной среде. Посевы помещают в термостат на 18-20 ч, после чего проводят учет и отбор колоний для дальнейшей идентификации по полной схеме лабораторного исследования.

Из изолированных колоний повторно делают мазки, их фиксируют и окрашивают, как описано выше. При отсутствии достаточного количества культуры исследование проводят на следующие сутки после накопления биомассы.

 

5.3. Биологический метод

 

В день поступления материала одновременно с бактериоскопией и посевами на питательные среды с целью выделения возбудителя сибирской язвы в обязательном порядке проводят биологическую пробу на восприимчивых лабораторных животных.

Для постановки биологической пробы используют белых беспородных мышей (массой 18-20 г), морских свинок (массой 350-400 г) или золотистых хомяков (массой 60-80 г). Исследуемый материал, подготовленный соответствующим образом (раздел "Подготовка проб к исследованию"), суспендируют в небольшом объеме стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия и вводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра 2 мышам в объеме 0,2-0,5 мл, 2 морским свинкам или 2 золотистым хомякам в объеме 0,5-1,0 мл. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 сут., иногда позже. При вскрытии трупов биопробных животных, павших от сибирской язвы, отмечают характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки на месте введения материала, гиперемию внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшуюся кровь. Из тканей и органов павших животных делают мазки-отпечатки, а также посевы на МПА или агар Хоттингера и селективную среду. Мазки-отпечатки фиксируют в спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин., а затем окрашивают раствором Ребигера или метиленовой синькой. В мазках при микроскопии сибиреязвенные бациллы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окружены розовой капсулой, зачастую сливающейся вокруг групп микробов. В посевах при просмотре чашек вырастают крупные шероховатые колонии с бахромчатой периферией. Идентификацию выросших колоний проводят вышеописанными методами.

В случаях, когда чистая культура возбудителя из посевов исходного материала на питательные среды получена раньше, чем наступает гибель зараженных этим материалом животных, суточной бульонной культурой заражают дополнительно двух мышей или морских свинок в дозах, указанных выше.

Наблюдение за животными ведут в течение 10 сут., после чего их исследуют, как описано выше. В целях ускорения исследования количество заражаемых белых мышей увеличивают до 6-10 особей и по одной мыши от каждой пробы забивают через 2-3 сут. после введения исходного инокулюма. В этом случае при вскрытии особое внимание уделяют месту введения. Если в исходном материале имеется достаточное количество сибиреязвенного микроба, то на месте введения можно обнаружить отек подкожной клетчатки. В мазках-отпечатках с места введения выявляются капсульные формы микроба, а в посевах - рост типичных колоний.

 

5.4. Иммуносерологические и аллергологические

методы исследования

 

5.4.1. Реакция преципитации по Асколи

Реакция позволяет в короткие сроки обнаружить сибиреязвенный антиген в экстрактах из струпьев язв больных, органов умерших от сибирской язвы людей, шкур и органов павших животных. Исследованию в реакции Асколи подвергают в том числе и загнивший биоматериал. Для постановки реакции необходимы: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, экстракт из исследуемого материала и сибиреязвенный бактерийный антиген для контроля.

Перед постановкой реакции свежий биоматериал выдерживают в термостате в течение 18-20 ч. Экстрагирование проводят горячим и холодным способами. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше преципитиногенов.

Для получения экстракта из патологического материала и струпьев горячим способом материал измельчают, заливают 0,9%-ным раствором натрия хлорида с 0,3%-ным раствором карболовой кислоты в соотношении 1:10 и кипятят в течение 30-40 мин., при холодном способе - оставляют для экстрагирования на 16-18 ч при комнатной температуре. Полученные экстракты фильтруют до полной прозрачности через фильтровальную бумагу или вату, предварительно смоченные 0,9%-ным раствором хлорида натрия. В узкие пробирки наливают 0,2-0,3 мл прозрачной сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, а затем пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на нее такое же количество полученного экстракта. Если реакция положительная, то на границе соприкосновения жидкостей не позднее 15 мин. должно появиться мутно-белое кольцо. Реакция оценивается знаком (+). При сомнительной реакции появление кольца наблюдается позднее 15 мин. (+/-). Если кольцо отсутствует, то реакция оценивается как отрицательная (-). Одновременно необходимо ставить три контрольных пробы: преципитирующая сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген; преципитирующая сыворотка плюс экстрагирующая жидкость; нормальная лошадиная сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген. Все контроли, кроме первого, должны быть отрицательными.

Исследование кожевенного и мехового сырья на сибирскую язву в реакции преципитации по Асколи проводят в соответствии с "Наставлением по исследованию кожевенного и мехового сырья реакцией преципитации", утвержденным Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 мая 1971 г.

Необходимо учитывать, что применяемые в настоящее время различные виды кислот и щелочей для выделки кожевенного сырья могут влиять на результаты реакции преципитации. Оптимальное значение pH экстрактов должно находиться в пределах 6,0-8,0. Кроме того, данный метод характеризуется недостаточно высокой чувствительностью, так как нередко дает отрицательный результат при исследовании заведомо сибиреязвенного материала.

Реакцию Асколи используют как экспресс-метод для обнаружения специфических сибиреязвенных антигенов у исследуемых культур. Для этого в 0,25-0,5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида ресуспендируют петлю суточной агаровой культуры. Экстрагирование проводят горячим методом, а постановку реакции вышеописанным способом. Учет результатов реакции проводят в течение 3 мин.

5.4.2. МФА для выявления специфических антител в сыворотке крови

В исключительных случаях можно проводить поиск противосибиреязвенных антител у больных непрямым МФА. С этой целью используют сыворотку диагностическую антивидовую против иммуноглобулинов человека люминесцирующую сухую. Для получения вегетативной культуры сибиреязвенного микроба используют споры вакцины СТИ, которые засевают на чашку с агаром Хоттингера (pH 7,2) и инкубируют в термостате при (36 +/- 1) град. С в течение 18-20 ч. После этого готовят суспензию вегетативных клеток на 0,9%-ном растворе натрия хлорида, доводя плотность инокулюма до ОСО мутности 10 ед. ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Полученную суспензию тщательно встряхивают и готовят из нее мазки на хорошо обезжиренных предметных стеклах, по 8 мазков на каждом стекле. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют 30 мин. в спирте с 3% перекиси водорода, вновь высушивают и расчерчивают восковым карандашом. При постановке этой реакции желательно использовать "свежие" мазки, при необходимости их можно хранить в холодильнике в закрытых чашках Петри в течение 3 суток.

    Исследуемую  сыворотку  от  больного  человека  инактивируют на водяной

бане при 56 град. С в течение  20  мин.  В качестве отрицательного контроля

используют  сыворотку  здорового человека, которую обрабатывают аналогичным

образом. Затем сыворотки титруют в пробирках или полистироловых планшетах в

0,9%-ном растворе натрия  хлорида  с  двукратным  шагом, отбирают с помощью

пастеровской  пипетки,  начиная  с  большего разведения, и наносят капли на

мазки  с вегетативной культурой сибиреязвенного микроба. Стекла помещают на

дно чашки Петри, закрывают крышкой и выдерживают 20-30 мин. при 37 град. С.

Затем мазки промывают  дважды  по  10 мин. в забуференном 0,9%-ном растворе

натрия  хлорида  и 10 мин. в дистиллированной воде. Стекла сушат на воздухе

при  комнатной  температуре,  после  чего  на мазки наносят люминесцирующую

сыворотку против иммуноглобулинов человека в рабочем титре, обозначенном на

ампуле.  Мазки  окрашивают  и  промывают  так  же,  как  и в первом случае.

Микроскопию  проводят  с  иммерсионной  системой.  Для оценки интенсивности

свечения  используют  четырехкрестовую  систему.  Положительным результатом

                       +    +

считается свечение на 3  и 4 .

У лиц, больных сибирской язвой, специфические антитела начинают появляться уже с 5-х сут. после начала болезни, и их титр нарастает до 21 и более суток. Увеличение титра антител можно проследить при исследовании парных сывороток с интервалом 5-7 дней. В МФА титры антител могут доходить до 1:640 - 1:1280, диагностическими считаются титры 1:16 - 1:32 и 4-кратное нарастание титров при повторном исследовании.

5.4.3. Реакция непрямой гемагглютинации

Для постановки серологических реакций РНГА (макро- и микрометоды) и РТНГА используется эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум для выявления сибиреязвенных спор в объектах внешней среды. Исследование материала проводится согласно инструкции по применению.

5.4.4. Кожно-аллергическая проба с сибиреязвенным аллергеном - антраксином

Организм больного, переболевшего сибирской язвой и иммунизированного против этой инфекции, обладает свойством отвечать аллергической реакцией в виде гиперемии и инфильтрации кожи на месте введения сибиреязвенного аллергена-антраксина. Эта реакция может появляться уже с первых дней и наблюдается у подавляющего числа больных с конца первой недели заболевания. Аллергическая перестройка организма у переболевших сибирской язвой может сохраняться длительное время, что позволяет использовать антраксин не только для диагноза текущего заболевания, но и для ретроспективной диагностики.

Антраксин вводят с соблюдением всех правил асептики строго внутрикожно в количестве 0,1 мл в нижней трети левого предплечья на внутренней стороне. На месте инъекции должна образовываться беловатая, хорошо ограниченная папула около 0,8 см в диаметре, имеющая вдавление на месте волосяных мешочков. В месте введения антраксина через 8-24 ч учитывается наличие гиперемии и инфильтрата. В зависимости от размеров этих элементов производят оценку пробы, руководствуясь приведенной ниже шкалой (табл.).

 

Таблица

 

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ПРОБЫ С АНТРАКСИНОМ

 

 

Приложение N 7

 

ИЛЛЮСТРАЦИИ К МЕТОДИЧЕСКИМ УКАЗАНИЯМ "ЛАБОРАТОРНАЯ

ДИАГНОСТИКА И ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ"

 

┌────────────────┐  ┌───────────────────┐       ┌─────────────┐     ┌─────────────────────────────┐

│    Образцы     │  │       ЛЮДИ        │<──────┤    Проба    ├────>│         ЖИВОТНЫЕ            │

│  из объектов   │  ├───────────────────┤<───┐  │с антраксином│     ├─────────────────────────────┤

│окружающей среды│  │Материал от больных│    │  └─────────────┘     │     Материал от больных     │

│                │  │  и трупов людей   │    └──────┬───┐     ┌─────┤      и трупов животных      │

└─────┬───┬─┬───┬┘  └───────┬─────────┬─┘           │МФА│     │     └──────┬────────┬────────┬────┘

      │   │ │   \/          │         │             │ИФА│     │            │        │        │

      │   │ │ ┌────┐        │         │             └───┘     │     ┌──────┴─────┬──┴───┬────┴────┐

      │   │ │ │РНГА│        │         │                       │     │   Мясо и   │Кожи, │ Старый, │

      │   │ │ └────┘        │         │                       │     │мясопродукты│шкуры,│загнивший│

      │   │ │┌──────────────┴────┐  ┌─┴───────────────────────┴───┐ │            │шерсть│ трупный │

      │   │ ││Секционный материал│  │   Патологический материал   │ │            │      │материал │

      │   │ │└──────────┬─────┬──┘  └┬───────────────────────────┬┘ └─┬──────────┴┬──┬──┴─┬──────┬┘

      │   │ \/          │     │      │                           │    │           │  │    │      │

      │   │┌───────────┐│     │      │       ┌───────────┐       │    │           │  │    \/     │

      │   ││Микроскопия││     │      │       │Микроскопия│       │ ┌──┘           \/ │ ┌───────┐ │

      │   ││мазков, МФА││     │      ├──────>│мазков, МФА│<──────┼─┘┌──────────────┐ │ │Реакция│ │

      │   │└───────────┘│     │      │       └───────────┘       │  │ Прогревание  │ │ │Асколи │ │

      │   \/            │     │      │    ┌─────────────────┐    │  │при 80 град. С│ │ └───────┘ \/

      │  ┌───────────┐  │     │      ├───>│       ПЦР       │<───┤  │   20 мин.    │ │        ┌───┐

      │  │Прогревание│  │     │      │    └─────────────────┘    │  └─┬────────────┘ ├───────>│ПЦР│

      │  │  при 80   │  │     │      │      /\ ┌───────────┐     │    │              │        └───┘

      │  │ град. С   │  │     │      │      │  │Микроскопия│     │    │              │

      │  │  20 мин.  │  │     \/     │      │  │мазков, МФА│     │    │              │

      \/ └────────┬──┘  │ ┌───────┐  │      │  └───────────┘     │    │              │

    ┌───┐         │     │ │Реакция│<─┤      │      /\            │    │              │

    │ПЦР│         │     │ │Асколи │  │  ┌───┴──────┴──────────┐  │    │              │

    └───┘         │     │ └───────┘  │  │Посев на селективный │  │    │              │

                  ├─────┼────────────┼─>│дифференциально-     │<─┼────┼──────────────┘

                  │     │            │  │диагностический агар,│  │    │

                  │     │            │  │агар Хоттингера      │  │    │

                  │     │            │  └──────────┬──────────┘  │    │

                  │     │            │             \/            │    │

                  │     │            │  ┌─────────────────────┐  │    │

                  │     │            │  │Посев на сектора МПА,│  │    │

                  │     │            │  │агара Хоттингера, МПБ│  │    │

                  │     │            │  └──────────┬──────────┘  │    │

                  │     │            │    /\       \/            │    │

                  │     │            │    │┌───────────────┐     │    │     ┌─────────────┐

                  │     │            │    ││ЧИСТАЯ КУЛЬТУРА├┐┌─┐┌┼────┼──┘\ │Идентификация│

                  │     │            │    ││               ├┘└─┘└┼────┼──┐/ │   культур   │

                  │     │            │    │└───────────────┘     │    │     └─────────────┘

                  \/    \/           \/   │                      \/   \/

                 ┌────────────────────────┴─────────────────────────────┐

                 │                       Биопроба                       │

                 └──────────────────────────────────────────────────────┘

 

Рис. 9. Общая схема лабораторного исследования

на сибирскую язву

 

┌──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│                                         ИССЛЕДУЕМАЯ КУЛЬТУРА                                         │

└─┬┬───────────┬──────────────────────────────────────────────────────┬───────────────────────────┬────┘

  ││           │                                                      │                           \/

  ││           │                        ┌────┐                        │   ┌────┐ ┌───────────────────────────────┐

  ││           │                        │ II │                        │   │III ├─┤      Дополнительные методы    │

  ││           \/                       └──┬─┘                        \/  └────┘ │         изучения культур      │

  ││  ┌────────────────────────────────────┴───────────────────────────────────┐ │                               │

  ││  │   ┌─────────────────────────────────────────────────────────────────┐  │ │1. Определение чувствительности│

  ││  │   │                  Основные методы идентификации                  │  │ │к антибиотикам.                │

  ││  │   └─────────────────────────────────────────────────────────────────┘  │ │2. Метод определения           │

  ││  │ 1. Тест на капсулообразование in vitro.  7. Морфология клеток в мазках.│ │гемолитической и               │

  ││  │ 2. Тест на патогенность для белых        8. Морфология колоний на      │ │протеолитической активностей.  │

  ││  │ мышей и морских свинок (биопроба,        плотной питательной среде и   │ │3. Тест на лецитиназу.         │

  ││  │ тест на капсулообразование in vivo).     характер роста в бульоне.     │ │4. Определение способности к   │

  ││  │ 3. Тест с бактериофагом.                 9. Спорообразование.          │ │росту на минимальной           │

  ││  │ 4. Тесты на чувствительность к           10. Тест на подвижность.      │ │питательной среде.             │

  ││  │ пенициллину.                                                           │ │5. Дифференциация культур      │

  ││  │ 5. Тест на щелочную фосфатазу.                                         │ │сибиреязвенного микроба по     │

  ││  │ 6. Тест на гемолиз на кровяном агаре.                                  │ │вирулентности in vitro.        │

  ││  └────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘ │6. Определение вирулентности   │

 ─┘└─    ┌─────┐                                                                 │выделенных культур in vivo.    │

 \  /    │  I  │                                                                 │7. Идентификация штаммов       │

  \/     └──┬──┘                                                                 │сибиреязвенного микроба с      │

┌───────────┴──────────────────────────────────────────────────────────────────┐ │атипичным капсулообразованием. │

│Ускоренная идентификация - ПЦР с праймерами к генам с плазмидной и хромосомной│ │8. Определение MLVA-генотипа.  │

│локализацией.                                                                 │ │                               │

└──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘ └───────────────────────────────┘

 

 

Рис. 10. Схема идентификации культур сибиреязвенного микроба

 

 

 

 

 

Приложение N 8

 

ВРЕМЕННОЙ ГРАФИК

ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА СИБИРСКУЮ ЯЗВУ

 

1-й день

 

1. Подготовка материала для исследования.

2. ПЦР.

3. РНГА.

4. МФА.

5. Реакция преципитации по Асколи.

6. Посев материала на питательные среды.

7. Заражение биопробных животных.

 

2-й день

 

При наличии роста на питательных средах

1. Отбор колоний на плотных и оценка характера роста на жидких питательных средах, микроскопия мазков из культур.

2. Рассев отобранных культур с питательных сред до отдельных колоний на плотных неселективных питательных средах.

    3. ПЦР ┐

           } с материалом из колоний.

    4. МФА ┘

 

При наличии чистых культур по результатам микроскопии и МФА

5. Отсев чистых культур из изолированных колоний на плотные неселективные питательные среды.

6. Постановка с материалом из чистых культур опорных идентификационных тестов (капсулообразование, на чувствительность к пенициллину, с бактериофагом, на щелочную фосфатазу, на гемолиз).

7. Наблюдение за биопробными животными, вскрытие павших, высевы на питательные среды и мазки-отпечатки из органов.

8. Микроскопия мазков от биопробных животных.

 

При отсутствии роста на питательных средах

Выполнение только пунктов 7 и 8.

 

3-й день

 

При наличии роста на питательных средах на второй день

1. Окончательный учет результатов опорных идентификационных тестов с чистой культурой.

2. Постановка остальных основных и дополнительных идентификационных тестов с чистой культурой.

3. Постановка с материалом из чистых культур опорных идентификационных тестов (капсулообразование, на чувствительность к пенициллину, с бактериофагом, на щелочную фосфатазу, на гемолиз).

4. При наличии чистой культуры и отсутствии павших животных заражение дополнительных животных материалом из бульонной или агаровой культуры.

 

При появлении роста на питательных средах только на третий день

1. Отбор колоний на плотных и оценка характера роста на жидких питательных средах, микроскопия мазков из культур.

2. Рассев отобранных культур с питательных сред до отдельных колоний на плотных неселективных питательных средах.

    3. ПЦР ┐

           } с материалом из колоний.

    4. МФА ┘

 

При наличии чистых культур по результатам микроскопии и МФА

5. Отсев чистых культур из изолированных колоний на плотные неселективные питательные среды.

6. Постановка с материалом из чистых культур опорных идентификационных тестов (капсулообразование, на чувствительность к пенициллину, с бактериофагом, на щелочную фосфатазу, на гемолиз).

 

Независимо от роста на питательных средах

7. Наблюдение за биопробными животными, вскрытие павших, высевы на питательные среды и мазки, отпечатки из органов.

8. Микроскопия мазков от биопробных животных.

 

4-10-й день

 

Проведение исследований по графику 2-3 дней в зависимости от роста на питательных средах и результатов биопроб.