"Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов A, B и C. Методические рекомендации" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

29 декабря 2007 г. N 0100/13745-07-34

Дата введения -

с момента утверждения

4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРЮШНОГО ТИФА

И ПАРАТИФОВ A, B И C

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработаны: ФГУН Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (Л.А.Кафтырева, З.Н.Матвеева, Г.Ф.Трифонова); ГОУВПО "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (А.Г.Бойцов).

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным Советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24.12.2007 N 11фц/5327).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 декабря 2007 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. В Методических рекомендациях изложены основные принципы и особенности бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов A, B и C; содержатся современные сведения о биологических свойствах возбудителей, резистентности к антибактериальным препаратам, о питательных средах для их выделения и особенностях дифференциации возбудителей брюшного тифа и паратифов от других серологических вариантов сальмонелл.

1.2. Методические рекомендации предназначены для специалистов микробиологических лабораторий, проводящих соответствующие исследования.

2. Список сокращений

АБП - антибактериальный препарат

ВСА - висмут-сульфит агар

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

МПК - минимальная подавляющая концентрация

П - промежуточный

У - устойчивый

Ч - чувствительный

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

ЦНС - центральная нервная система

В таблицах:

"+" - положительная реакция в первые сутки;

"-" - отрицательная реакция на 4-20 сутки;

"(+)" - замедленная положительная реакция на 2-20 сутки;

d - различные ферментативные реакции.

Возможна дифференциация на ферментативные варианты.

3. Общие положения

3.1. Брюшной тиф и паратифы А, В и С являются антропонозными кишечными инфекциями, вызываемыми микроорганизмами Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B и Salmonella Paratyphi C. В настоящее время чаще регистрируется брюшной тиф, реже - паратиф B, редко - паратиф A и крайне редко - паратиф C.

3.2. Заболевания характеризуются язвенным поражением лимфатической системы тонкой кишки, бактериемией, лихорадкой, циклическим клиническим течением с выраженной интоксикацией, розеолезной сыпью на кожных покровах туловища, гепато- и спленомегалией. Более характерен запор, нежели диарея. Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки примерно в 1% случаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника с самыми неблагоприятными последствиями для больного.

3.3. Диагноз брюшного тифа и паратифов A, B и C ставится на основании клинических признаков болезни с учетом эпидемиологического анамнеза и данных комплексного лабораторного обследования, которое включает классические бактериологический и серологический методы. Бактериологическая диагностика имеет приоритетное значение, т.к. в этом случае удается получить наиболее полную информацию о биологических свойствах возбудителя, включая его чувствительность к антибактериальным препаратам.

3.4. Применение антимикробных препаратов для этиотропной терапии брюшного тифа и паратифов позволило, с одной стороны, снизить летальность с 10-20% до уровня менее 1%, а с другой стороны, осложнило лабораторную диагностику, т.к. нередко забор материала для лабораторного исследования осуществляется уже после начала антибиотикотерапии. Этот факт заставляет более тщательно подходить к вопросу выбора материала для исследования, взятия исследуемого материала, техники исследования.

3.5. Современной особенностью эпидемиологии брюшного тифа является резкое увеличение частоты завоза (заноса) инфекции с эндемичных по этому заболеванию территорий, стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение жителей России при выезде в эти страны и в процессе миграции внутри страны. Другой особенностью является наличие обширного контингента высокого эпидемиологического риска в виде лиц без определенного места жительства, среди которых регистрируется высокая заболеваемость брюшным тифом.

3.6. Данные Методические рекомендации составлены с целью унификации методов бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов A, B и C, а также правильной интерпретации результатов лабораторного исследования с учетом современных особенностей клиники, лечения и эпидемиологической обстановки на конкретных территориях.

4. Показания к проведению бактериологической диагностики

Показанием к проведению бактериологического исследования биологического материала на наличие возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C является необходимость обследования:

4.1) больных с подозрением на тифопаратифозное заболевание, а также с лихорадкой неясной этиологии, продолжающейся 5 и более дней;

4.2) лиц, общавшихся с больными брюшным тифом и паратифами A, B, C;

4.3) работников отдельных профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по эпидемиологическим показаниям;

4.4) лиц перед поступлением в стационары и специализированные санатории по клиническим и эпидемиологическим показаниям;

4.5) лиц при оформлении на стационарное лечение в больницы (отделения) психоневрологического (психосоматического) профиля, дома престарелых, интернаты для лиц с хроническими психическими заболеваниями и поражениями ЦНС, в другие типы закрытых учреждений с круглосуточным пребыванием;

4.6) больных брюшным тифом и паратифами после исчезновения клинических симптомов перенесенного заболевания перед выпиской из стационара;

4.7) лиц, переболевших брюшным тифом и паратифами, во время диспансерного наблюдения;

4.8) хронических бактерионосителей, выявленных среди работников отдельных профессий, производств и организаций, при повторном поступлении на работу на указанные предприятия и объекты;

4.9) секционного материала при подозрении на заболевание брюшным тифом и паратифами.

5. Материально-техническое обеспечение метода

5.1. Стандартное испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения для микробиологических лабораторий.

5.2. Питательные среды, диагностические сыворотки и химические реагенты для культивирования, выделения, идентификации и определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C.

5.3. Для лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний и выявления бактерионосителей должны использоваться питательные среды и реагенты, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

6. Лабораторная диагностика брюшного тифа и паратифов

6.1. Принцип бактериологического метода основан на обнаружении живых микроорганизмов в различных биологических субстратах (кровь, моча, кал, желчь, костный мозг, розеолы) в зависимости от стадии заболевания. Для этого производят посев определенного количества биологического материала на специальные питательные среды с последующей инкубацией в термостате и идентификацией выросших колоний микроорганизмов, характерных для S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B и S. Paratyphi C, по культурально-ферментативным свойствам и антигенной характеристике.

6.2. Только бактериологическое исследование может обеспечить точную постановку этиологического диагноза и контроль освобождения организма от возбудителя. В отношении дифференциальной диагностики брюшного тифа и паратифов единственным методом является лабораторное исследование биологического материала с выделением возбудителя и идентификация его до уровня серологического варианта, т.к. клиническое течение инфекционного процесса не всегда позволяет различить эти нозологические формы.

7. Бактериологическое исследование

7.1. Выделение возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C проводят по одной и той же схеме бактериологического исследования биоматериалов.

7.2. Порядок сбора материала для лабораторных исследований на тифопаратифозные заболевания определен СП 3.1.1.2137-06.

7.3. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории описана в МУ 4.2.2039-05.

7.4. Материалом для бактериологического исследования с целью диагностики брюшного тифа и паратифов являются:

кровь;

испражнения;

моча;

желчь (дуоденальное содержимое).

Возбудители могут быть также выделены из:

розеол;

костного мозга;

грудного молока.

Материалом для бактериологического исследования с целью выявления бактерионосителей согласно СП 3.1.1.2137-06 являются:

испражнения;

моча;

желчь (дуоденальное содержимое).

7.5. Исследование секционного материала проводится с целью уточнения диагноза.

7.6. Сбор биологического материала для лабораторных исследований осуществляется до начала этиотропного лечения: медицинским работником, заподозрившим тифопаратифозную инфекцию; при групповой и вспышечной заболеваемости - специалистами учреждений Роспотребнадзора и персоналом лечебно-профилактических учреждений. От госпитализируемых больных материал для бактериологического исследования забирается в приемном отделении стационара.

7.7. От лиц, общавшихся с больными или носителями (контактными), сбор материала проводится медицинскими работниками ЛПУ и других организаций и учреждений по месту выявления больных.

7.8. Биоматериал для лабораторного исследования сопровождают специальным направлением. Доставка материала самими обследуемыми не допускается. При невозможности своевременной доставки материала используют консерванты и транспортные среды (табл. 1).

Таблица 1

ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДЫ И КОНСЕРВАНТЫ, НАИБОЛЕЕ ЧАСТО

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ ИСПРАЖНЕНИЙ

Название среды	Обеспечивает сохранение
среда Кэрри-Блер	всех кишечных патогенов, включая кампилобактерии
среда Эймс	всех энтеробактерий
среда Стюарт	сальмонелл и шигелл
глицериновая смесь	всех энтеробактерий, кроме иерсиний; предпочтительна для шигелл
фосфатная буферная смесь	всех энтеробактерий
боратно-буферный раствор	всех энтеробактерий
физиологический раствор	всех энтеробактерий, включая кампилобактерии

8. Бактериологическое исследование крови

Показанием к исследованию крови является подозрение на тифопаратифозные заболевания или лихорадочное состояние невыясненного происхождения (лихорадка неясного генеза), наблюдающееся в течение 5 и более дней (СП 3.1.1.2137-06).

Соотношение кровь - питательная среда должно быть 1:10 - 1:60. Количество независимо отбираемых проб крови и время их взятия определяется лечащим врачом согласно МУ 4.2.2039-05 при лихорадке неясного генеза или согласно МУ 04-723/3 МЗ СССР (1984) при подозрении на тифопаратифозные заболевания. У больных, получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо собирать непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы препарата.

При наличии лихорадки оптимальным является взятие крови на фоне повышения температуры тела (но не на пике температуры!). Посев на питательные среды проводят непосредственно у постели больного.

При подозрении на тифопаратифозные заболевания для посева крови можно использовать среду Рапопорт, 20%-й желчный бульон, мясопептонный бульон с добавлением 1%-й глюкозы (во флаконах по 100 мл). Ранее использовали посев крови в стерильную дистиллированную (водопроводную) воду. Однако предпочтительнее использовать специальные среды для посева крови.

Количество засеваемой крови в разгар лихорадки может составлять 10 мл, в более поздние сроки - до 20 мл (у детей - до 5 мл).

При лихорадке неясного генеза продолжительностью более 5 дней, как правило, должны исследоваться несколько проб крови. Взятие крови из вены проводят согласно МУ 4.2.2039-05. Это необходимо для дифференциации истинной бактериемии от случайной контаминации крови при венопункции (вероятность загрязнения пробы вследствие случайного прокола сальной или потовой железы составляет 3%). Для посева крови в этом случае используют две среды: 1) среду для аэробов и факультативных анаэробов и 2) среду для облигатных анаэробов (например, "двойная" среда + тиогликолевая среда согласно Приказу МЗ СССР от 12.04.1985 N 535) или универсальную среду для аэробов и анаэробов.

Предпочтительно использовать промышленно произведенные среды, разрешенные к применению в России.

Посевы инкубируют при 37 град. С в течение 10 суток с ежедневным просмотром. При этом флаконы с "двойной" средой наклоняют, омывая плотную часть среды.

При отсутствии признаков роста на 10-й день выдается отрицательный ответ.

При наличии признаков роста (помутнение, покраснение среды Рапопорт, появление видимых колоний на плотной части "двойной" среды) проводят высев параллельно на полиуглеводную среду и плотную среду в чашках Петри (кровяной агар в случае лихорадки неясного генеза и среда Эндо при подозрении на тифопаратифозные заболевания).

Прямой высев на полиуглеводные среды проводят для сокращения сроков исследования исходя из предположения, что при посеве крови с высокой вероятностью будет наблюдаться рост монокультуры возбудителя. Для контроля этого предположения и выделения чистой культуры путем откола отдельных колоний необходим параллельный высев на среду Эндо или кровяной агар.

Если на этих средах наблюдается рост монокультуры, то можно учитывать биохимические свойства по полиуглеводной среде. Для контроля чистоты культуры необходимо провести микроскопию мазка с полиуглеводной среды, окрашенного по Граму. На этом этапе возможна также постановка реакции агглютинации на стекле с соответствующими агглютинирующими О- и Н-сальмонеллезными сыворотками и выдача предварительного ответа.

Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы представлена на рис. 1.

Схема бактериологического исследования крови пациентов при лихорадке неясного генеза представлена на рис. 2.

┌──────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Больной с подозрением на тиф/паратифы │

└────────────────────────────────┬─────────────────────────────────┘

│ Посев крови в соотношении к питательной среде 1:10 - 1:60 │

│ на среду Рапопорт, желчный бульон или аналогичные среды │

Инкубация при 37 град. С с ежедневным просмотром

│

┌──────────────────────┐ │ ┌──────────────────┐

│ Роста нет │<────────┴─────────────>│ Рост есть │

└─────────┬────────────┘ └────────┬─────────┘

\/ \/

┌──────────────────────┐ ┌───────────────────────────┐

│ Продолжать инкубацию │ │ Высев на среду Эндо │

│ до 10 суток │ │ и полиуглеводную среду │

└──────────────────────┘ └─────────────────┬─────────┘

Инкубация при 37 град. С 18-24 ч

│

┌─────────────────────────────────────────┐

│ Контроль чистоты культуры по среде Эндо │

└─┬──────────────────────────┬────────────┘

│ \/

┌────────────────────────┐ │ ┌───────────────────────────────┐

│ Культура чистая │<─────┴──────>│ Культура смешанная │

└───────────┬────────────┘ └──────────────────┬────────────┘

\/ \/

┌────────────────────────────────┐ ┌───────────────────────────────────┐

│ Учет биохимических свойств, │ │Откол бесцветных колоний диаметром │

│ продолжение идентификации, │ │ 2-3 мм на полиуглеводную среду │

│ определение чувствительности │ └──────────────────────┬────────────┘

│ к АБП │ │

└────────────────────────────────┘ │

/\ \/

└────────────────────────── Инкубация при 37 град. С 18-24 ч

Рис. 1. Схема бактериологического исследования крови

пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы

│ Больной с лихорадкой неясного генеза │

│ Посев крови в соотношении к питательной среде 1:10 - 1:60 │

│ на "двойную" среду и тиогликолевую среду │

Инкубация при 37 град. С с ежедневным просмотром

│

┌──────────────────────┐ │ ┌──────────────────┐

│ Роста нет │<────────┴─────────────>│ Рост есть │

└─────────┬────────────┘ └────────┬─────────┘

\/ \/

┌──────────────────────┐ ┌───────────────────────────┐

│ Продолжать инкубацию │ │ Высев на кровяной агар │

│ до 10 суток │ │ и полиуглеводную среду │

└──────────────────────┘ └─────────────────┬─────────┘

Инкубация при 37 град. С 18-24 ч

│

┌─────────────────────────────────────────┐

│ Контроль чистоты культуры по росту │

│ на кровяном агаре │

└─┬───────────────────────────────────────┘

│

┌────────────────────────┐ │ ┌───────────────────────────────┐

│ Культура чистая │<─────┴──────>│ Культура смешанная │

└───────────┬────────────┘ └──────────────────┬────────────┘

\/ \/

│ Учет биохимических свойств, │ │ Откол сероватых, прозрачных или │

│ продолжение идентификации, │ │опалесцирующих, блестящих колоний, │

│ определение чувствительности │ │ диаметром обычно > 1 мм на │

│ к АБП │ │ полиуглеводную среду │

└────────────────────────────────┘ └──────────────────────┬────────────┘

/\ │

│ \/

└────────────────────────── Инкубация при 37 град. С 18-24 ч

Рис. 2. Схема бактериологического исследования крови

пациентов с лихорадкой неясного генеза

Ход дальнейшей идентификации культуры по культурально-морфологическим, ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен далее в соответствующих разделах.

9. Бактериологическое исследование испражнений

Пробы испражнений отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой бумаги. Материал собирается с помощью ложки-шпателя, вмонтированного в крышку стерильного контейнера. В отсутствие контейнера со шпателем для отбора материала используют любой стерильный инструмент (стерильный деревянный шпатель, проволочная петля, ложечка и т.п.). При наличии патологических примесей необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но свободные от крови. Образцы жидких испражнений отбирают с помощью стерильной пластиковой пастеровской пипетки с замкнутым резервуаром.

Объем забираемого материала должен быть не менее 2 г. Оптимальным является взятие материала в случае оформленного стула в объеме грецкого ореха; в случае жидкого стула его слой в контейнере должен быть не менее 1,5-2,0 см. Материал, помещенный в стерильный контейнер, доставляется в лабораторию в течение 2 ч.

Если материал невозможно доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант (транспортную систему со средой). Объем материала не должен превышать 1/3 объема среды.

Испражнения должны быть тщательно гомогенизированы в среде. Образцы могут храниться до начала исследования в течение суток в условиях холодильника (4-6 град. С).

Транспортные среды и консерванты, используемые для выделения возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C, а также других возбудителей острых кишечных инфекций, представлены в табл. 1.

Пробы испражнений, собранные непосредственно из прямой кишки с помощью ректального тампона, используют преимущественно для объективизации диагноза (МУ 4.2.2039-05). Взятие материала осуществляется средним медицинским персоналом. Как правило, специальный зонд для взятия мазка входит в состав транспортной системы. Важно отметить, что попадание транспортных сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный тампон должен погружаться в транспортную среду только после взятия материала. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу бедрами и ладонями развести ягодицы. Зонд-тампон вводят в задний проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси, собирают материал с крипт ануса. Осторожно извлекают зонд-тампон и погружают его в транспортную среду. Транспортирование тампона без среды не допускается.

В лаборатории посев проб испражнений проводят непосредственно на плотные дифференциально-диагностические питательные среды и параллельно на среду обогащения.

Схема бактериологического исследования испражнений представлена на рис. 3.

┌──────────────┐ ┌─────────────────────────┐

│ Нативные │ │ Приготовить суспензию в │

│ испражнения ├─────────────────────>│консерванте в соотношении│

│ │ │ 1:3 │

└──────┬───────┘ └────────────┬────────────┘

\/ \/

Доставить в течение 2 ч Можно сохранять до 12-24 ч

│ в холодильнике

\/ │

┌──────────────────────────────────────┐ │

│ Приготовить суспензию в 0,9%-м ├─────┐ │

│растворе NaCl в соотношении 1:5 - 1:10│ │ │

└───────────────┬──────────────────────┘ │ │

│ ┌─────────────────┼──────────────┤

\/ \/ \/ \/

┌────────────────────────────┐ ┌───────────────────────────────────────┐

│ Плотные среды: ВСА, Эндо, │ │ Обогатительные среды: │

│ Плоскирева, SS-агар, ЭМС │ │ Мюллера-Кауфмана, селенитовая или др. │

│ или др. │ │ Соотношение материал - среда 1:5 │

└───────────────┬────────────┘ └──────────┬────────────────────────────┘

│ │

\/ \/

Инкубация 18-24 ч при 37 град. С. Просмотр через 18-24 ч

│ ВСА - через 24 и 48 ч

│ │

│ \/

│ ┌─────────────┐

│ │Высев на ВСА │

│ └────┬────────┘

│ \/

│ Инкубация при 37 град. С

│ Просмотр через 24 и 48 ч

│ │

\/ \/

┌────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│Откол подозрительных колоний на полиуглеводные среды: │

│ВСА - черные с почернением среды. S. Paratyphi A - цвета среды. │

│Некоторые серовары - коричневые. Среды Эндо, Плоскирева, │

│ЭМС - цвета среды; │

│SS-агар - цвета среды с черным центром │

└────────────────────────────┬───────────────────────────────────┘

Инкубация при 37 град. С 18-24 ч

│

┌─────────────────────────────────────────────────────┐

│ Дальнейшая идентификация в зависимости от характера │

│ роста культуры на полиуглеводной среде │

└─────────────────────────────────────────────────────┘

Рис. 3. Схема бактериологического исследования испражнений

Из нативных испражнений готовят суспензию в 0,9%-м растворе хлорида натрия в соотношении 1:5 - 1:10, оставляют на 30 мин. для оседания крупных частиц. После этого одну каплю надосадочной жидкости засевают на чашки с плотными питательными средами и 1 мл суспензии - в среду обогащения (соотношение материал - среда должно быть 1:5).

Испражнения, доставленные в лабораторию в консерванте (транспортной среде), перед посевом должны быть тщательно гомогенизированы в среде, после чего проводят прямой посев материала на плотные среды и среду обогащения в тех же соотношениях, что и нативные испражнения.

Пробы испражнений, собранные с помощью ректального тампона, исследуются аналогично испражнениям, доставленным в консерванте. Следует помнить, что ректальный тампон содержит меньшее количество микроорганизмов по сравнению с нативными испражнениями, поэтому посевная доза должна быть увеличена.

Максимальное выявление S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B и S. Paratyphi С в испражнениях достигается при использовании сред обогащения, хотя у больных в остром периоде заболевания возбудитель достаточно часто выделяют и при прямом посеве. Посев на среды обогащения параллельно с прямым высевом обязателен!

Все посевы инкубируют при 37 град. С на дифференциально-диагностических средах 18-24 ч, на висмут-сульфит агаре - 24-48 ч. Через 24 ч проводят высев со сред обогащения на плотные среды (висмут-сульфит агар или среду Эндо). Колонии, характерные для данных возбудителей, выросшие на плотных средах, отсевают на полиуглеводную среду.

Необходимо отметить, что техника распределения материала по поверхности чашки с плотными средами должна обеспечить рост изолированных колоний типичного вида, по которому можно визуально оценить культуральные свойства микроорганизма.

Для выделения S. Typhi предпочтительнее использовать висмут-сульфит агар (ВСА). Типичные колонии S. Typhi имеют черный цвет и окружены черным или коричневым ободком с металлическим блеском. Однако при обильном росте S. Typhi часто не дает характерного почернения ВСА, поэтому чашки должны быть засеяны так, чтобы обеспечить рост отдельных колоний.

Пробы фекалий можно засевать на стандартные селективные среды для энтеробактерий, разрешенные к применению на территории Российской Федерации. Тем не менее, для выделения S. Typhi предпочтительнее всего использовать висмут-сульфит агар. Ход дальнейшей идентификации культур по ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен далее в соответствующих разделах.

10. Бактериологическое исследование мочи

Посев мочи производят для диагностики с первых дней заболевания и вплоть до выписки больного, а также с целью выявления бактерионосительства. Так как при тифе и паратифах выделение возбудителя с мочой происходит периодически и кратковременно, исследования мочи необходимо проводить повторно с промежутками 5-7 дней.

Следует строго придерживаться общих правил сбора мочи, изложенных в МУ 4.2.2039-05. Вне зависимости от способа получения мочи она должна быть доставлена в лабораторию в течение 2 ч. В крайнем случае допускается хранение мочи в течение ночи в холодильнике.

Следует помнить, что в зависимости от химического состава мочи бактерии в ней могут при хранении как отмирать, так и размножаться.

Увеличение срока сохранения материала может крайне затруднить интерпретацию результата.

Производят прямой посев мочи (или осадка после центрифугирования) без предварительного обогащения согласно Приказу МЗ СССР N 535 на плотные дифференциально-диагностические среды, рекомендуемые для сальмонелл, в том числе возбудителей брюшного тифа и паратифов. Параллельно нативная моча засевается в среды обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1 или осадок мочи - в среды обычной концентрации. Посевы помещают в термостат при 37 град. С на 18-24 ч, а затем со среды обогащения производят высев на плотные дифференциально-диагностические среды. Колонии, выросшие на плотных средах, идентифицируют по культурально-ферментативным и серологическим свойствам.

11. Бактериологическое исследование желчи

(дуоденального содержимого)

Желчь собирают в три стерильные пробирки или стерильные одноразовые контейнеры раздельно по порциям A, B, C согласно МУ 4.2.2039-05 и доставляют в лабораторию.

Проводят исследование каждой порции (A, B, C) отдельно или готовят смесь из трех порций. Пробы засевают:

- на плотные дифференциально-диагностические среды (ВСА, Эндо, ЭМС или др.) в количестве 0,5 мл;

- в пробирку (флакон) с питательным бульоном в соотношении 1:10. Нет необходимости засевать желчь на среды обогащения, т.к. желчь сама является хорошей питательной средой для возбудителей брюшного тифа и паратифов.

Засеянные среды вместе с остатками желчи инкубируют при 37 град. С.

Через 18-24 ч просматривают посевы на плотных питательных средах (результаты роста на ВСА учитывают через 24 и 48 ч) и делают пересев подозрительных колоний на полиуглеводную среду.

Из питательного бульона производят высевы на плотные дифференциально-диагностические среды.

Из оставшейся желчи в случае отрицательного результата прямого посева делают повторные высевы на плотные дифференциально-диагностические среды через 18-24 ч и на 3, 5, 7 и 10 сутки.

Проводят идентификацию выросших микроорганизмов по культурально-морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам.

12. Бактериологическое исследование материала из розеол

Бактериологическое исследование ("соскоб" с розеол) проводят при наличии хорошо выраженных розеол. Материал собирают асептически. Для этого участок кожи над розеолами обрабатывают 70%-м этиловым спиртом, затем протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9%-м раствором хлористого натрия, и осушают стерильным тампоном.

Материал для исследования (тканевую жидкость) получают путем скарификации кожи над розеолой с помощью скальпеля. На поврежденную кожу наносят 1-2 капли желчного бульона или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают с выступившей тканевой жидкостью и собирают пастеровской пипеткой или аналогичным одноразовым стерильным устройством в пробирку с одной из жидких сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.). В лаборатории посев выдерживают при 37 град. С 18-24 ч с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, ЭМС, ВСА).

Дальнейшее исследование проводят, как при бактериологическом исследовании другого биологического материала.

13. Бактериологическое исследование костного мозга

Хорошо известно, что при лабораторном подтверждении диагноза "брюшной тиф" наиболее результативным является бактериологическое исследование костного мозга (высеваемость возбудителя составляет 90-95%). Даже у пациентов с легкими и стертыми формами брюшного тифа, трудными для клинического распознавания, а также на фоне приема антимикробных препаратов высеваемость миелокультур значительно выше, чем гемокультур.

Однако на практике бактериологическое исследование костного мозга проводится очень редко, только по особым клиническим показаниям при отсутствии других лабораторных данных, подтверждающих диагноз брюшной тиф или паратиф, т.к. эта инвазивная процедура достаточно травматична. Забор материала для исследования проводят только в условиях стационара при наличии соответствующего специалиста.

Материал для бактериологического исследования (аспират) в количестве 0,50-0,75 мл получают асептически, путем проведения пункции грудины (рукоятки или тела) и засевают в пробирку с одной из сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.).

Если аспират невозможно засеять в среду обогащения сразу после пункции, его собирают в стерильную пробирку и немедленно направляют в лабораторию, где производится посев в среду обогащения. В лаборатории посевы инкубируют при 37 град. С 18-24 ч с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды.

14. Питательные среды и реактивы

Перечень питательных сред для выделения и идентификации возбудителей кишечных инфекций, в частности энтеробактерий, обширен и неуклонно расширяется. Выбор конкретных сред во многом обусловлен местными экономическими условиями и традициями. Тем не менее, при этом следует руководствоваться несколькими основными принципами.

14.1. В описании питательной среды должно быть указано, что она может быть использована не просто для выявления сальмонелл, а именно Salmonella Typhi и S. Paratyphi A, B и C.

14.2. Следует отдавать предпочтение сухим питательным средам известных производителей по сравнению со средами, непосредственно изготовляемыми в лаборатории.

14.3. Каждая партия питательной среды в лаборатории должна контролироваться с помощью тест-штаммов (внутренний контроль качества).

14.4. Для лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний и выявления бактерионосителей должны использоваться питательные среды и реагенты, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

15. Методы изучения ферментативных свойств

В настоящее время для изучения ферментативной активности микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включая возбудителей брюшного тифа и паратифов, разработаны, выпускаются и зарегистрированы различные диагностические тест-системы отечественного и зарубежного производства (от наиболее простых классических сред Гисса в пробирках и планшетах до автоматических анализаторов). Если тест-системы позволяют идентифицировать микроорганизм до уровня рода и выявлять особенности ферментативной активности штаммов, то они могут быть использованы для идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов. Методика работы с тест-системами подробно изложена в инструкциях по применению и их следует строго соблюдать.

16. Биологические свойства возбудителей

Возбудители брюшного тифа и паратифов A, B и C относятся к семейству Enterobacteriaceae, роду Salmonella, виду enterica, подвиду I (enterica) и обладают морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, характерными для данного подвида, вида, рода и семейства.

У представителей рода сальмонелл вида enterica исторически сложилась ситуация, когда для обозначения сероваров использовали не антигенную формулу, как у других бактерий, а названия болезней (человека или животных), страны, города или улицы, где они были выделены, и др. Ошибочно считать эти названия видовыми, т.к. они не имеют таксономического статуса. Тем не менее, названия наиболее часто встречающихся сероваров сальмонелл настолько привычны, что заменить их антигенными формулами практически нереально. Поэтому в современной схеме Кауфмана-Уайта при обозначении сальмонелл только вида enterica подвида I вместо видового обозначения используют название серовара, но пишут его с заглавной буквы.

Таким образом, полные названия возбудителей брюшного тифа и паратифов следующие:

- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi;

- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A;

- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B;

- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C.

В обычной практике возможно использование сокращенных вариантов названий:

- Salmonella ser. Typhi или Salmonella Typhi, или S. Typhi;

- Salmonella ser. Paratyphi A или Salmonella Paratyphi A, или S. Paratyphi A;

- Salmonella ser. Paratyphi B или Salmonella Paratyphi B, или S. Paratyphi B;

- Salmonella ser. Paratyphi C или Salmonella Paratyphi C, или S. Paratyphi C.

16.1. Культурально-морфологические свойства

Подвижные грамотрицательные палочки не образуют спор и капсул, факультативные анаэробы хорошо растут на обычных питательных средах.

На простом питательном агаре - слегка выпуклые с ровным краем и гладкой поверхностью, влажные с блеском колонии более 1 мм.

На дифференциально-диагностических средах (содержащих лактозу как дифференцирующее вещество) - прозрачные, бесцветные или голубоватые, а иногда розоватые или цвета среды колонии (среды Эндо, Плоскирева, ЭМС и другие аналогичные среды).

На SS-агаре - колонии цвета среды с черным центром.

На висмут-сульфитной среде - изолированные колонии S. Typhi, S. Paratyphi B - черные с характерным металлическим блеском, среда под колонией прокрашена в черный цвет. Колонии S. Paratyphi A - зеленоватые, светлые в цвет среды, нежные.

Штаммы S. Paratyphi B (возбудитель паратифа B) на мясопептонном агаре могут образовывать по периферии колоний приподнятый слизистый вал. Слизистый вал развивается на 2-5 сутки при хранении посевов при комнатной температуре. Этот признак не является постоянным и диагностическим.

16.2. Ферментативные свойства

Изучение ферментативных свойств проводится в отношении набора углеводов, многоатомных спиртов, аминокислот и других органических соединений, применяемых при идентификации и изучении сальмонелл и других энтеробактерий. Как правило, в практических лабораториях используют небольшое количество тестов, позволяющих идентифицировать основные роды, входящие в семейство кишечных бактерий. Характеристика ферментативных свойств сальмонелл, включая возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C, представлена в табл. 2.

Таблица 2

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРЮШНОГО ТИФА

И ПАРАТИФОВ A, B, C

┌──────────────┬──────────┬────────┬────────────┬────────────┬────────────┐

│ Субстрат │Salmonella│S. Typhi│S. Paratyphi│S. Paratyphi│S. Paratyphi│

│ │ spp. │ │ A │ B │ C │

├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤

│Глюкоза (газ) │ + │ - │ + │ + │ + │

│Лактоза │ - │ - │ - │ - │ - │

│Маннит │ + │ + │ + │ + │ + │

│Сахароза │ - │ - │ - │ - │ - │

│Индол │ - │ - │ - │ - │ - │

│Продукция H2S │ + │ + │ + │ + │ + │

│Мочевина │ - │ - │ - │ - │ - │

│Рамноза │ + │ + │ + │ d │ + │

│Ксилоза │ d │ d │ - │ + │ + │

│Мальтоза │ + │ + │ + │ + │ + │

│Сорбит │ + │ + │ + │ + │ + │

│Арабиноза │ + │ d │ + │ + │ d │

│Дульцит │ d │ - │ + │ + │ + │

│Инозит │ d │ - │ - │ d │ - │

│Лизин │ + │ + │ - │ + │ + │

│Орнитин │ + │ - │ + │ + │ + │

│Аргинин │ + │ + │ + │ + │ + │

│Цитрат │ d │ - │ - │ d │ + │

│Симмонса │ │ │ │ │ │

│Ацетат натрия │ - │ - │ - │ - │ - │

│Адонит │ - │ - │ - │ - │ - │

│Раффиноза │ - │ - │ - │ - │ - │

│Салицин │ - │ - │ - │ - │ - │

│Фогес- │ - │ - │ - │ - │ - │

│Проскауэра │ │ │ │ │ │

│Метилрот │ + │ + │ + │ + │ + │

│Желатин │ - │ - │ - │ - │ - │

│Малонат натрия│ - │ - │ - │ - │ - │

│Фенилаланин │ - │ - │ - │ - │ - │

│Бета- │ - │ - │ - │ - │ - │

│галактозидаза │ │ │ │ │ │

│D-тартрат │ + │ + │ - │ - │ + │

│Мукат │ + │ + │ + │ + │ + │

│Трегалоза │ + │ + │ + │ + │ + │

│Галактуронат │ - │ - │ - │ - │ - │

│Бета- │ d │ d │ d │ d │ d │

│глюкоронидаза │ │ │ │ │ │

└──────────────┴──────────┴────────┴────────────┴────────────┴────────────┘

Анализ данных литературы, посвященный многолетнему наблюдению за ферментативными свойствами, показывает, что встречаются штаммы с "отклонениями" в ферментативных реакциях (очень редко!). Эти "отклонения" проявляются в отношении большинства субстратов, приведенных в таблице. Вариабельность ферментативных свойств не является показанием для исключения принадлежности такого штамма к конкретному серологическому варианту.

Однако такие штаммы требуют более тщательного изучения в референс-лабораториях или центрах по сальмонеллам во избежание ошибок! И это правило распространяется на все серовары сальмонелл.

Штаммы перечисленных серологических вариантов имеют ряд важных особенностей ферментативных свойств, по которым они могут быть идентифицированы.

Штаммы S. Typhi:

- не образуют газ при ферментации глюкозы;

- слабо продуцируют сероводород. На полиуглеводных средах визуально отмечается слабое почернение среды или его отсутствие;

- не растут на среде Симмонса, т.к. являются ауксотрофами и не способны утилизировать цитрат как единственный источник углерода;

- дают положительную реакцию на среде с лизином и аргинином (+) и отрицательную реакцию с орнитином (-);

- вариабельно ферментируют ксилозу и арабинозу и по этой характеристике выделяют четыре ферментативных варианта S. Typhi, которые могут служить эпидемиологическими маркерами штаммов (табл. 3).

Таблица 3

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ S. TYPHI

Ферментативный вариант	I	II	III	IV
Ксилоза	+	-	+	-
Арабиноза	-	-	+	+

Штаммы S. Paratyphi A:

- ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, как и большинство представителей рода Salmonella;

- не продуцируют сероводород. На полиуглеводных средах отсутствует потемнение и почернение среды. Это свойство отражается на цвете колоний, вырастающих на висмут-сульфит агаре;

- дают отрицательную реакцию на среде с лизином (-) и положительную реакцию с орнитином и аргинином (+);

- не ферментируют ксилозу (-);

- ферментируют арабинозу (+).

Штаммы S. Paratyphi B

Ферментативная активность возбудителя паратифа В характерна для большинства представителей рода Salmonella, вида enterica, подвида 1 (enterica), вызывающих сальмонеллезную инфекцию у людей. Однако этот серовар включает два биологических варианта с одинаковой антигенной структурой, но различающихся по способности ферментировать d-тартрат. До 2001 г. в схеме Кауфмана-Уайта они относились к разным сероварам и имели различные названия: серовар S. Paratyphi В, штаммы которого d-тартрат отрицательные, и серовар S. Java, штаммы которого ферментируют d-тартрат. Определение способности ферментировать d-тартрат имеет важное эпидемиологическое значение, так как S. Java (d-тартрат положительные штаммы) обычно выделяют от животных или из продуктов животного происхождения, подозреваемых в качестве источника или фактора передачи инфекции.

S. Paratyphi В (d-тартрат отрицательные), как правило, вызывают заболевания у людей и очень редко выделяются от животных. В 2001 г. серовар Java официально исключен из схемы Кауфмана-Уайта, и d-тартрат положительные штаммы в современной схеме рассматриваются как биовар серовара S. Paratyphi B (табл. 4).

Таким образом, в настоящее время серологический вариант S. Paratyphi B

с антигенной структурой 1, 4, [5], 12:b:1,2 включает два биовара,

различающихся по ферментации d-тартрата:

- +

S. Paratyphi B d-тартрат и S. Paratyphi B d-тартрат .

Таблица 4

РАЗЛИЧНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ

S. PARATYPHI B

┌────────────────────┬───────────┬───────────────────────────────┐

│Антигенная структура│Ферментация│ Серологический вариант │

│ антигены │d-тартрата │ по схеме Кауфмана-Уайта │

├─────────────┬──────┤ ├──────────────┬────────────────┤

│ О- │ Н- │ │ 1-7 издание, │ 8 издание, 2001│

│ │ │ │ 1953 - 1988 │ │

├─────────────┼──────┼───────────┼──────────────┼────────────────┤

│1, 4, [5], 12│b:1,2 │ - │S. Paratyphi B│S. Paratyphi B │

│- │ │ │ │ - │

│ │ │ │ │(d-тартрат ) │

├─────────────┼──────┼───────────┼──────────────┼────────────────┤

│1, 4, [5], 12│b:1,2 │ + │S. Java │S. Paratyphi B │

│- │ │ │ │ + │

│ │ │ │ │(d-тартрат ) │

└─────────────┴──────┴───────────┴──────────────┴────────────────┘

Эти изменения в схеме Кауфмана-Уайта затрагивают только обозначения (названия) сальмонелл с одинаковой антигенной структурой и не касаются эпидемиологических особенностей заболеваний, вызываемых этими биологическими вариантами.

В повседневной практической работе можно сохранить старые названия этого серовара, однако знать об изменениях в схеме необходимо для того, чтобы правильно трактовать материалы зарубежной литературы. Прописи сред с d-тартратом представлены в МУ 04-723/3 МЗ СССР, 1984.

В случае выделения S. Paratyphi В от людей, объектов окружающей среды, животных или из продуктов животного происхождения, подозреваемых в качестве источника или фактора передачи инфекции, необходимо определять биовар по отношению к d-тартрату. Выполнение этой процедуры позволит избежать диагностических ошибок. Этот тест служит эпидемиологическим маркером штамма.

Штаммы S. Paratyphi C

Ферментативная характеристика штаммов S. Paratyphi C не имеет выраженных отличительных особенностей. Ферментативные реакции такие же, как и у других широко распространенных сероваров сальмонелл. На питательных средах штаммы S. Paratyphi C растут в виде характерных для сальмонелл колоний.

В то же время следует помнить, что штаммы трех сероваров серологической группы C - S. Paratyphi C, S. Typhisuis и S. Choleraesuis - имеют практически одинаковую антигенную структуру и могут быть надежно дифференцированы по культуральным и ферментативным признакам, подтверждающим достоверность серологической идентификации возбудителя. На ВСА штаммы S. Typhisuis и S. Choleraesuis дают атипичные колонии: они образуют светло-зеленые колонии, видимые лишь к 48 ч инкубации (S. Choleraesuis - мелкие, S. Typhisuis - мельчайшие). Штаммы S. Typhisuis на среде Эндо растут в виде мелких колоний. Среда Плоскирева практически непригодна для выделения этого серовара, так как отмечается ингибирующий рост эффект: колонии мельчайшие, едва заметные невооруженным глазом, рост проявляется к 48 ч инкубации. В пределах серовара S. Choleraesuis известен вариант "kunzendorf", штаммы которого отличаются стойким отсутствием фазы 1 антигена Н ("с") и ферментативными особенностями. Культуральные и ферментативные свойства этих сероваров необходимо знать и учитывать при идентификации, т.к. S. Typhisuis и S. Choleraesuis являются хозяин-адаптированными сальмонеллами для свиней. Характеристика ферментативных свойств этих сероваров представлена в табл. 5.

Таблица 5

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ

S. PARATYPHI C, S. TYPHISUIS, S. CHOLERAESUIS,

S. CHOLERAESUIS VAR. KUNZENDORF

Субстрат	Salmonella
Субстрат	Paratyphi C	Typhisuis	Choleraesuis	Choleraesuis var. kunzendorf
Антигенная формула	О- 6,7, [Vi]: Н- с:1,5	О- 6,7: Н- с:1,5	О- 6,7: Н- с:1,5	О- 6,7: Н- -:1,5
Глюкоза (газ)	+	-	+	+
Лактоза	-	-	-	-
Маннит	+	-	+	+
Сахароза	-	-	-	-
Индол	-	-	-	-
Сероводород	+	-	-	+
Мочевина	-	-	-	-
Рамноза	+	+	+	+
Ксилоза	+	+	+	+
Мальтоза	+	(+)	+	+
Сорбит	+	-	+	+
Арабиноза	d	-	+	d
Дульцит	+	(+)	-	d
Инозит	-	-	-	d
Лизин	+	-	+	+
Аргинин	+	-	-	-
Орнитин	+	+	+	+
Цитрат Симмонса	+	-	+	+
d-тартрат	+	-	+	+

16.3. Антигенная структура и серологическая идентификация

Антигенная структура возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C сложная, как у других представителей рода сальмонелл. В практической работе микробиологов при идентификации серологического варианта сальмонелл во внимание принимаются три основных антигенных комплекса: О-, Н-, Vi-. Именно этот принцип положен в основу антигенной классификации сальмонелл в схеме Кауфмана-Уайта.

Возбудители брюшного тифа и паратифов относятся к разным серологическим группам сальмонелл. Возбудитель брюшного тифа (Salmonella Typhi) принадлежит к серологической группе D, возбудитель паратифа A (Salmonella Paratyphi A) - к серологической группе A, возбудитель паратифа B (Salmonella Paratyphi B) - к серологической группе B, возбудитель паратифа C (Salmonella Paratyphi C) - к серологической группе C. Полная антигенная структура этих микроорганизмов представлена в табл. 6.

Таблица 6

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРЮШНОГО ТИФА

И ПАРАТИФОВ A, B, C СОГЛАСНО СХЕМЕ КАУФМАНА-УАЙТА (2001)

Серовариант	Серогруппа	О-антигенный комплекс	Vi-антиген	Н-антигены
Серовариант	Серогруппа	О-антигенный комплекс	Vi-антиген	Фаза 1	Фаза 2
S. Paratyphi A	A	1, 2, 12 -	-	a	[1,5]
S. Paratyphi B	B	1, 4, [5], 12 -	-	b	1,2
S. Paratyphi C	C	6, 7	[Vi]	c	1,5
S. Typhi	D	9, 12	[Vi]	d	-

Примечание к таблице.

Схема Кауфмана-Уайта является таблицей антигенных формул известных сероваров сальмонелл и создана для целей практической идентификации штаммов. Детали, не нужные для определения серовара, в схеме не приводятся, однако некоторые из них будут обсуждены в данном примечании.

1. Антигены, входящие в состав О-антигенных комплексов, обусловленные

фаговой конверсией, в схеме подчеркнуты (например, О-антиген 1). Эти

антигены присутствуют только в том случае, если штаммы лизогенизированы

соответствующим конвертирующим фагом.

2. [] = Факторы О-антигенного комплекса, указанные в квадратных скобках, могут присутствовать или отсутствовать у штаммов вне зависимости от фаговой конверсии (например, О-фактор [5] серогруппы B О:4).

3. [] = Факторы Н-антигенов, заключенные в квадратные скобки, указывают, что они редко обнаруживаются и, как правило, были идентифицированы у "диких" штаммов. Например, подавляющее большинство штаммов S. Paratyphi A - монофазные. Они содержат Н-антиген 1-й фазы - "а". В редких случаях могут быть выделены дифазные штаммы S. Paratyphi A с антигеном 2-й фазы Н:1,5. Поэтому в схеме в формуле этого серовара Н-антиген 2-й фазы указан в квадратных скобках [1,5].

4. Наиболее важными в идентификации возбудителя брюшного тифа и паратифа С являются идентификация Vi-антигена. Однако содержание этого антигена в культурах S. Typhi и S. Paratyphi C может варьировать. Соответственно количеству его в культурах, в частности S. Typhi, последние можно подразделить на три группы:

V-форма - содержит Vi-антиген в большом количестве и является О-инагглютинабельной;

W-форма - не имеет Vi-антигена и является О-агглютинабельной;

VW-форма - промежуточная, она содержит Vi-антиген и тем не менее является О-агглютинабельной.

Большинство штаммов S. Typhi содержит Vi-антиген, особенно развит он в свежевыделенных штаммах и культурах, выращиваемых при 37 град. С.

Следует запомнить, что присутствие или отсутствие дополнительных О- или Н-факторов (подчеркнутых или в квадратных скобках) не влияет на определение серологического варианта штамма. В то же время, эти факторы интересны как эпидемиологические маркеры штаммов, принадлежащих к одному серовару.

5. Очень редко штаммы сальмонелл, включая возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C, могут обладать так называемой "R-фазой" Н-антигена.

В практических лабораториях такие штаммы не смогут быть идентифицированы до уровня серовара при традиционном серотипировании.

Дальнейшее детальное изучение таких штаммов (идентичных по ферментативным свойствам S. Typhi, S. Paratyphi A, B, C) должно проводиться в национальных (региональных) сальмонеллезных центрах. Как правило, подтвердить серовар у таких штаммов можно с помощью дополнительных методов (молекулярно-генетических).

17. Чувствительность к антибактериальным препаратам

В настоящее время отмечен неуклонный рост резистентности штаммов энтеробактерий к широкому спектру антимикробных препаратов. Уже во второй половине прошлого столетия были зарегистрированы вспышки брюшного тифа, вызванные возбудителем, резистентным к левомицетину (в Мексике). В развивающихся странах Южной Азии (Индия, Бангладеш, Вьетнам, Пакистан и Таджикистан) и Южной Африки, эндемичных по брюшному тифу, появились штаммы S. Typhi, резистентные к нескольким антимикробным препаратам, традиционно применявшимся в качестве терапии первой линии - ампициллину, хлорамфениколу (левомицетину) и ко-тримаксозолу, и их число стало стремительно увеличиваться. В последние годы в странах Азии полирезистентные штаммы составляют до 80% всех выделенных возбудителей, поэтому указанные препараты утратили свое значение при терапии брюшного тифа.

Современными препаратами выбора при лечении брюшного тифа и паратифов являются фторхинолоны. В ряде случаев, особенно при лечении детей, возможно применение цефалоспоринов третьего поколения. Однако штаммы, резистентные к налидиксовой кислоте и обладающие пониженной чувствительностью к ципрофлоксацину, также становятся эндемичными для стран Азии.

Согласно действующим методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам МУК 4.12.1890-04 следует проводить определение чувствительности выделенного микроорганизма к АБП, если уровень его устойчивости не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. S. Typhi, как и сальмонеллы других сероваров, обладает природной чувствительностью к широкому спектру АБП. Но т.к. в последние годы отмечается распространение штаммов S. Typhi, резистентных к большинству традиционных антибактериальных препаратов, применявшихся ранее для лечения брюшного тифа, у всех выделенных культур S. Typhi необходимо в обязательном порядке определять чувствительность к АБП.

Рекомендуемый перечень АБП, подлежащих исследованию при изучении чувствительности штаммов возбудителей брюшного тифа и паратифов (МУК 4.12.1890-04):

- ампициллин;

- цефалоспорин третьего поколения (цефотаксим и/или цефтазидим);

- налидиксовая кислота <*>;

- триметоприм-сульфаметоксазол (ко-тримоксазол);

- хлорамфеникол <**>;

- тетрациклин <**>.

--------------------------------

<*> В случае устойчивости к налидиксовой кислоте необходимо определить чувствительность к ципрофлоксацину, т.к. у штамма высока вероятность пониженной чувствительности к этому препарату. Действующие в нашей стране МУК 4.12.1890-04 рекомендуют включить в набор для тестирования Enterobacteriaceae из группы хинолонов только препараты, относящиеся к фторированным хинолонам (норфлоксацин, ципрофлоксацин или офлоксацин). В то же время, убедительно доказано, что устойчивость к этой группе антимикробных препаратов развивается ступенчато и затрагивает в первую очередь налидиксовую кислоту. Как правило, штаммы, резистентные к налидиксовой кислоте, характеризуются сниженной чувствительностью к фторхинолонам, хотя при тестировании их в лаборатории они рассматриваются как чувствительные к фторированным хинолонам согласно действующим критериям оценки (МПК <= 1 мг/л). В связи с этим целесообразно включить налидиксовую кислоту в перечень препаратов, обязательных для тестирования возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C. Так как диско-диффузионный метод не позволяет уловить низкие уровни устойчивости к ципрофлоксацину, у штаммов, резистентных к налидиксовой кислоте, необходимо определять МПК ципрофлоксацина или других фторхинолонов методом серийных разведений.

<**> В перечень препаратов для определения чувствительности включены хлорамфеникол и тетрациклин; эти препараты не применяются в настоящее время для лечения, но результаты определения чувствительности к ним могут иметь определенное значение для эпидемиологического мониторинга. При проведении эпидемиологического надзора за антимикробной резистентностью, а также с целью проведения дополнительного типирования штаммов (внутри серовара) перечень исследуемых АБП может быть расширен.

Определение чувствительности штаммов S. Typhi, S. Paratyphi A, B и C к АБП следует проводить в строгом соответствии с МУК 4.12.1890-04 диско-диффузионным методом или методом серийных разведений с обязательным контролем качества проводимого исследования (с использованием контрольных референтных штаммов). Интерпретация результатов изучения штаммов представлена в табл. 7.

Таблица 7

КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ ENTEROBACTERIACEAE

(В ТОМ ЧИСЛЕ S. TYPHI, S. PARATYPHI A, B И C) И ПОГРАНИЧНЫЕ

ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И МПК (МГ/Л)

(МУК 4.12.1890-04)

Антибактериальные препараты	Диаметр зон подавления роста и значения МПК			E. coli АТСС 25922
Антибактериальные препараты	У	П	Ч	E. coli АТСС 25922
Ампициллин	<= 13 мм >= 32 мг/л	14-16 мм 16 мг/л	>= 17 мм <= 8 мг/л	16-22 мм 2-8 мг/л
Триметоприм- сульфаметоксазол (ко-тримоксазол)	<= 10 мм >= 4/76 мг/л	11-15 мм -	>= 16 мм <= 2/38 мг/л	23-29 мм <= 0,5/9,5 мг/л
Цефотаксим	<= 14 мм >= 64 мг/л	15-22 мм 16-32 мг/л	>= 23 мм <= 8 мг/л	29-35 мм 0,03-0,12 мг/л
Цефтазидим	<= 14 мм >= 32 мг/л	15-17 мм 16 мг/л	>= 18 мм <= 8 мг/л	25-32 мм 0,06-0,5 мг/л
Налидиксовая кислота	<= 13 мм >= 32 мг/л	14-18 мм -	>= 19 мм <= 16 мг/л	22-28 мм 1-4 мг/л
Ципрофлоксацин	<= 15 мм >= 4 мг/л	16-20 мм 2 мг/л	>= 21 мм <= 1 мг/л	30-40 мм 0,004-0,016 мг/л
Хлорамфеникол	<= 12 мм >= 32 мг/л	13-17 мм 16 мг/л	>= 18 мм >= 8 мг/л	21-27 мм 2-8 мг/л
Тетрациклин	<= 14 мм >= 16 мг/л	15-18 мм 8 мг/л	>= 19 мм <= 4 мг/л	18-25 мм 0,5-2,0 мг/л

18. Ускоренные методы выделения и идентификации возбудителей

В настоящее время бурно развиваются методы для ускоренной лабораторной диагностики различных заболеваний, включая тифопаратифозные. К ним относятся молекулярно-генетические, иммунохроматографические методы, иммуноферментный анализ и др. Эти методы могут быть использованы на различных этапах бактериологического исследования (непосредственно в биологическом материале, на этапе идентификации микроорганизма на уровне колоний или чистой культуры, при определении чувствительности к антибактериальным препаратам). На современном этапе эти методы носят ориентировочный характер и дополняют, но не заменяют классическое бактериологическое исследование.

Каждая лаборатория в зависимости от своих возможностей и наличия на рынке тест-систем может использовать их для ускоренной диагностики брюшного тифа и паратифов A, B и C согласно инструкции производителя.

Для ускоренного выявления возбудителей сальмонеллезов, включая брюшной тиф и паратифы, была неоднократно рекомендована реакция иммунофлюоресценции. При необходимости может быть использован и непрямой метод РИФ. Диагностические препараты для постановки РИФ прямым методом (иммуноглобулины сальмонеллезные к антигенам групп A, B и D диагностические флуоресцирующие сухие) производятся ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (филиал "Медгамал"). С помощью РИФ возможна идентификация возбудителя только до уровня серологической группы. Постановка реакции осуществляется согласно рекомендациям производителя диагностических препаратов.

Список литературы

1. Профилактика брюшного тифа и паратифов: СП 3.1.1.2137-06. М.: Роспотребнадзор, 2006.

2. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории: МУ 4.2.2039-05.

3. Приказ МЗ СССР от 22.04.1985 N 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".

4. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: МУК 4.12.1890-04. М., 2004.

5. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями: МУ 04-723/3. М.: МЗ СССР, 1984.

6. Antigenic formulas of the Salmonella serovaras/Michel Y. Popoff,

WHO Collaborating Center for Reference and Research on Salmonella. 8

edition. France, Paris, Institute Pasteur, 2001.