УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации,

Первый заместитель

Министра здравоохранения

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

2 марта 2002 года

 

Дата введения:

1 мая 2002 г.

 

3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА

 

ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ЧУМНОГО МИКРОБА

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУ 3.3.1.1113-02

 

1. Разработаны: Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (Т.И.Анисимова, Л.В.Саяпина, Г.М.Сергеева), Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" (И.В.Исупов, Р.А.Белобородов, Л.В.Самойлова, А.П.Анисимов, М.Ю.Ледванов, Г.П.Шведун, С.Ю.Задумина, А.Ф.Касьян, А.Л.Кравцов). Научно-исследовательским институтом микробиологии министерства обороны РФ (И.В.Маракулин, А.В.Ежов, Е.М.Дармова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (протокол N 12 от 14.02.02).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 2 марта 2002 г.

4. Введены взамен методических указаний "Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба", утв. Минздравом СССР 08.08.74.

 

1. Область применения

 

1.1. Методические указания "Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба" разработаны в помощь специалистам научно-исследовательских учреждений, осуществляющих разработку и контроль вакцинных штаммов.

 

2. Нормативные ссылки

 

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы:

2.1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2. Методические указания "Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба", утверждены Минздравом СССР 8.08.74.

2.3. РД 42-28-24-88 "Медицинские иммунобиологические препараты. Основные термины и определения".

2.4. РД 42-281-91 "Государственные приемочные испытания МИБП. Порядок проведения. Основные положения".

2.5. Положение о государственной регистрации, сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации. Постановление ГКСЭН от 3.06.94 N 5.

2.6. Санитарные правила СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности".

2.7. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96 "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

 

Введение

 

Возбудитель чумы относится к особо опасным микроорганизмам I группы патогенности. Для профилактики чумы в России применяют живую вакцину, поэтому безопасность (безвредность) вакцинных штаммов в основном решается на этапе доклинических лабораторных государственных испытаний. Основной задачей настоящих методических указаний является изложение обязательных требований к штаммам чумного микроба - кандидатам в вакцинные, критериев оценки и методов исследования, позволяющих отобрать для последующих клинических испытаний безопасные и высокоиммуногенные штаммы чумного микроба.

Все испытания аттенуированных штаммов чумного микроба, перспективных в качестве вакцинных, проводят в сравнении с эталонным вакцинным штаммом чумного микроба EV линии НИИЭГ, получаемым в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

На основании результатов государственных лабораторных (доклинических) испытаний, одобренных национальным органом контроля (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) и Комитетом медицинских и иммунобиологических препаратов (МИБП), о соответствии нового штамма Y. pestis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам данными методическими указаниями, Министерство здравоохранения Российской Федерации разрешает проведение клинических ограниченных, затем государственных испытаний на добровольцах живой вакцины, приготовленной на основе этого штамма, по программе, согласованной с национальным органом контроля и Комитетом МИБП. После утверждения Министерством здравоохранения испытуемого штамма в качестве нового вакцинного, дальнейшие этапы внедрения живой вакцины проводят в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

 

3. Общие положения

 

3.1. Для изготовления живой вакцины используют штаммы чумного микроба, стабильно утратившие патогенность для человека и животных, проявляющие остаточную вирулентность для мышей и, в больших дозах, для морских свинок.

3.2. Все исследования по испытанию кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба должны проводиться в изолированном помещении, в котором не должно быть микроорганизмов I-II групп патогенности.

3.3. Испытуемый и контрольный эталонный вакцинный штаммы чумного микроба должны быть зашифрованы специалистами, не принимающими участия в проведении исследований.

3.4. Вся работа с зашифрованными испытуемым и контрольным штаммом до отнесения испытуемого штамма к III группе патогенности должна проводиться как с микроорганизмами I группы патогенности.

3.5. Для испытаний используют двухсуточные агаровые культуры второй генерации, полученные из лиофилизированных культур испытуемого штамма и контрольного вакцинного штамма чумного микроба EV линии НИИЭГ из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

    Концентрацию  клеток  в  микробных  взвесях  агаровых  культур

определяют   по   стандарту  мутности   ГИСК    им. Л.А.Тарасевича

                                                                 9

(ОСО 42-28-59-86П),   10 единиц    которого   эквивалентны  1 x 10

микробных клеток (м.к.) в 1 мл.

 

4. Идентификация штамма по видовым признакам

 

4.1. Чумной микроб относится к роду Yersinia, вида pestis. Y. pestis - облигатный паразит, природный ауксотроф с факультативным анаэробным типом дыхания, грамотрицательная палочка. Чумные микробы ферментируют с образованием кислоты без газа глюкозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, маннит, мальтозу, не ферментируют - сахарозу, лактозу и рамнозу (за исключением Горноалтайских и Закавказских штаммов); не образуют индол, не гидролизуют мочевину, океанические штаммы не ферментируют глицерин, континентальные - ферментируют. Характерный R-тип колоний формируется на 2-4 сутки роста при оптимальной для развития температуре (28 +/- 1) град. C. Лизируются чумным диагностическим фагом Л-413 с.

4.2. Возбудитель чумы имеет три собственные плазмиды-пестициногенности (pPst), кальцийзависимости (pCad) и плазмиду pFra, имеющие молекулярные массы соответственно ~= 6, ~= 47 и ~= 60 MD. Плазмида pPst детерминирует продукцию пестицина, иммунность к нему, синтез активатора плазминогена, отвечающего за плазмокоагулазную и фибринолитическую активности. Оба продукта плазмиды pPst являются видоспецифическими белками, имеют важное диагностическое значение. Плазмида pCad определяет зависимость роста клеток Y. pestis при температуре (37 +/- 1) град. C от наличия в питательной среде ионов кальция, а так же детерминирует биосинтез V антигена и Yops (Yersinia outer membrane proteins -белков внешней мембраны). Штаммы, лишенные этой плазмиды, авирулентны. Протективным действием для белых мышей обладает V антиген. Плазмида pCad не является видоспецифической, ее варианты обнаруживают у всех патогенных представителей рода Yersinia, причем эти плазмиды обладают значительной степенью генетической гомологии. Однако, несмотря на значительное функциональное и структурное подобие, на видовом уровне эти плазмиды различаются по способности обеспечивать продукцию отдельных белков внешних мембран, которые имеют ведущее значение, как в выражении вирулентности возбудителя, так и в видовой специфичности. Плазмида pFra детерминирует биосинтез капсульного антигена Y. pestis (FI) и "мышиного" токсина (Тох). Антиген FI является основным иммуногеном Y. pestis. Оба антигена относятся к видоспецифическим.

Видовая специфичность чумного микроба определяется в основном генами, имеющими плазмидную локализацию.

Испытуемый штамм, предлагаемый в качестве вакцинного, должен соответствовать или превосходить эталонный вакцинный по показателю иммуногенности, соответствовать контрольному штамму по показателям безвредности и реактогенности или быть более безопасным, а по некоторым несущественным характеристикам, которые характеризуют его как представителя вида или разновидности Y. pestis, могут отличаться от него.

4.3. Исследуемый штамм - кандидат в вакцинные, должен:

- лизироваться чумным бактериофагом Л-413С;

- быть типичным по культурально-морфологическим свойствам;

- титр FI испытуемого штамма не должен быть меньше аналогичного показателя, полученного с культурой контрольного штамма Y. pestis EV, выращенного в аналогичных условиях;

- доля кальцийнезависимых мутантов в популяции культур чумного микроба, пропассированных через организм лабораторных животных и не подвергавшихся длительному хранению или каким-либо физическим воздействиям, не должна превышать 0,3%;

- не должен уступать контрольному штамму по фибринолизин-плазмокоагулазной активности;

- испытуемый и контрольные штаммы не должны обладать способностью к пигментсорбции;

- испытуемые вакцинные штаммы аналогично эталонному штамму EV на электрофореграмме должны иметь 3 полосы плазмидной ДНК, соответствующие pFra (60 MD), pCad (47 MD) и pPst (6 MD).

Методики определения видовых признаков испытуемого и контрольного штаммов приведены в прилож. 1.

 

5. Определение степени остаточной вирулентности

(безвредности) испытуемого штамма чумного микроба

по распространяемости и приживаемости в органах

морских свинок

 

Методика определения безвредности нового вакцинного штамма приведена в прилож. 2.

О безвредности культуры испытуемого штамма судят по реакции организма морских свинок на ее введение, по приживаемости и распространяемости в организме, по выявленным у подопытных морских свинок патоморфологическим изменениям, степени выраженности и обратимости. В качестве контроля в этих экпериментах используют группу морских свинок, привитых культурой вакцинного штамма У. pestis EV и обследуемых аналогичным образом.

    5.1. Испытуемый  и  эталонный вакцинный штаммы чумного микроба

                                                           2

не должны вызывать гибель  морских  свинок, привитых 1 x 10  - 1,5

    10

x 10   м.к.

5.2. Вакцинные штаммы чумного микроба должны обладать определенной степенью остаточной вирулентности, т.е. в течение некоторого времени размножаться, распространяться и задерживаться в организме привитых животных, в результате чего развивается доброкачественный вакцинальный процесс. Хорошо размножающиеся и приживающиеся в организме лабораторных животных вакцинные штаммы Y. pestis обладают более выраженной иммуногенностью по сравнению с культурами, у которых слабо проявляются эти свойства.

    5.3. Бактерии вакцинных  высокоиммуногенных  штаммов Y. pestis

должны размножаться в организме привитых морских свинок  в течение

первых   3-15 сут.,   обусловливая  тем   самым   иммунологическую

перестройку  организма. Через 30 сут. организм морских свинок, как

правило,  освобождается от микробов.  Бактерии  вакцинных  штаммов

Y. pestis   могут  приживаться   в   организме  морских  свинок  и

выявляются   в  высевах  из   места   введения  и  из  регионарных

лимфатических   узлов  в  течение   20-30 сут.   Поэтому   микробы

высокоиммуногенного    вакцинного   штамма   обязательно    должны

обнаруживаться при высевах на  питательные среды из места введения

                                                                 9

культуры и регионарных лимфатических узлов.  При  введении 2 x 10

          10

и 1,5 x 10   м.к.  возможно  также  выделение их в течение  первых

10-15 сут. из селезенки и из печени.

    5.4. Для   вакцинного   штамма  чумного микроба  при подкожном

методе введения допустимо выделение микробов:

    - из места  введения  и  регионарного лимфатического  узла  до

                                                               9

20-30 сут. (в единичных случаях более 30 сут.) при дозах 2 x 10  и

        10

1,5 x 10   м.к. в виде сливного (4+) или обильного роста (3+), при

       7                                                 2

дозе 10  м.к. - около 100-200 колоний (2+) и  при дозе 10  м.к. -

до 10 и иногда более колоний (1+);

                                                               9

    - в посевах печени и селезенки от животных, привитых 2 x 10  и

        10

1,5 x 10   м.к.  в  течение  2  недель  может  вырасти  более  100

                    7

колоний, привитых 10  м.к. - около  50-100   колоний,  от  морских

                    2

свинок,  привитых 10  м.к.,  из печени и селезенки  чумной  микроб

обычно не выделяется;

    - в посевах из легких, крови и костного мозга, как правило, не

должно быть роста чумных микробов. У отдельных животных  (не более

1%) в течение 3-5 сут.  после введения массивных  доз  исследуемой

                9           10

культуры (2 x 10  и 1,5 x 10   м.к.)  в  посевах  из легких, крови

или костного мозга могут вырастать единичные колонии Y. pestis.

    5.5. При  введении  животным культуры штаммов  с  недостаточно

                                                                 9

стабилизированным  клеточным составом  в массивных дозах  (2 x 10

          10

и 1,5 x 10   м.к.) большая часть клеток, потерявшая вирулентность,

ведет себя в организме, подобно живой вакцине,  и уже в первые дни

индуцирует   формирование   специфического  иммунитета.  На   фоне

приобретенного иммунитета оставшиеся в культуре вирулентные клетки

могут  не вызывать развития чумной инфекции ("феномен переживания"

микробов),    потому   что   действие   их    нейтрализуется   уже

сформировавшимися  специфическими защитными механизмами хозяина, и

животные, как правило, выживают. В этом случае  возможно ошибочное

заключение   о  соответствии   исследуемого   штамма  по  признаку

безвредности требованиям, предъявляемым к вакцинным.

    Только  в  том случае, когда в популяции  исследуемого  штамма

много  вирулентных  клеток,  или большая часть клеток недостаточно

снизила  свою  вирулентность, или организм   подопытных   животных

ослаблен  и не  успевает приобрести специфическую резистентность,

животное  погибает  от  чумы или  переболевает ей. При определении

безвредности   нового  вакцинного  штамма  для  выявления  в   его

популяции  вирулентных  клеток   необходимо,  как  сказано   выше,

проводить испытания культур на животных  не только путем  введения

                  9           10                         7

массивных  (2 x 10  и 1,5 x 10   м.к.),   но  средних (10  м.к.) и

         2        2

малых (10 и 5 x 10  м.к.)  доз.   Малые  дозы  чумного  микроба  с

недостаточно   сниженной   вирулентностью  могут  вызывать  гибель

морских свинок или недопустимые изменения в их органах и тканях.

 

6. Оценка безвредности исследуемого штамма Y. pestis

в опытах на белых мышах

 

    Культуры   вакцинных  штаммов  чумного  микроба  при подкожном

                                                   2    3    5   7

введении  белым  мышам  массой 18-20 г  в  дозах 10 , 10 , 10 и 10

м.к. не должны вызывать их гибели. Каждую дозу вводят 10 животным.

Наблюдение  за  ними проводят в течение  20 сут.  В случае  гибели

белых  мышей  их исследуют  патологоанатомически,  морфологически,

бактериологически. Методика  исследования приведена  в  п.п. 4 и 5

прилож. 2.

 

7. Определение стойкости утраты вирулентности

бактериями исследуемого штамма в опытах

на морских свинках

 

Методика проведения пассажей приведена в прилож. 3.

В результате 10-кратного подкожного пассирования исследуемых культур через организм морских свинок не должна повыситься остаточная вирулентность штамма, не должны изменяться его культуральные, морфологические и биохимические свойства; плазмидный профиль. Степень приживаемости микробов в организме может усилиться, но вакцинный штамм чумного микроба в организме морских свинок и белых мышей не должен реверсировать в вирулентную форму, способную в организме восприимчивого животного вызывать изменения, свойственные чумной инфекции.

 

8. Определение реактогенности штамма для морских свинок

(прижизненные наблюдения) при подкожном

способе введения

 

Методика определения реактогенности вакцинного штамма для морских свинок приведена в прилож. 2.

    8.1. Высокоиммуногенный  вакцинный   штамм   чумного   микроба

клинически  должен вызывать  допустимые местную  и  общую реакции.

Интенсивность и продолжительность реактивных изменений  у  морских

свинок  зависит  от  дозы  введенных вакцинных микробов  и степени

                                                           2

остаточной вирулентности  изучаемого штамма. Малая доза (10  м.к.)

вызывает  у  морских  свинок незначительное  повышение температуры

тела и снижение массы. В течение 7-10 сут. в  месте введения могут

пальпироваться   ограниченные   очаги  уплотнения  мягких  тканей,

регионарные  лимфатические  узлы  могут  быть увеличены, но должны

быть подвижными, т.е. не спаянными с окружающими мягкими тканями.

                                             9           10

    8.2. При испытании массивных  доз (2 x 10  и 1,5 x 10  м.к.) у

отдельных   животных  возможно   повышение   температуры  тела  на

1,5-2 град. C.   Среднее  повышение температуры  тела  для  группы

                                                           2    7

морских  свинок   (30-40 голов),  которым  было  введено 10 , 10 ,

      9           10

2 x 10  и 1,5 x 10   м.к. исследуемого штамма, не должно превышать

1 град. C. К 7-12 дню после введения вакцинного штамма температура

тела морских   свинок   должна  снизиться  до  нормальных исходных

значений.

                                   9           10

    8.3. В ответ на введение 2 x 10  и 1,5 x 10   м.к.  вакцинного

штамма чумного микроба в первые 5 сут. может снижаться  масса тела

морских  свинок. К 6-7 суткам  после введения  испытуемой культуры

снижение  массы животных не должно превышать 1/5 ее первоначальной

величины.

У половины опытных животных допустимо развитие обширных отеков в месте введения культуры, может наблюдаться увеличение, уплотнение и спаянность регионарных лимфатических узлов с мягкими тканями.

 

9. Определение безвредности исследуемых вакцинных

штаммов для морских свинок по морфологическим

показателям при подкожном способе введения

 

Безвредность испытуемых штаммов по морфологическим показателям определяется в экспериментах на морских свинках при подкожном способе введения.

Степень остаточной вирулентности испытуемого штамма характеризуют специфические для вакцинального процесса морфологические (макроскопические и гистологические) изменения, возникающие у морских свинок в тканях в месте введения культуры, в регионарных, контрлатеральных и отдаленных лимфатических узлах, а также во внутренних органах (печени, селезенке, почках). Методика вскрытия и исследования морских свинок приведена в прилож. 2.

9.1. Общие критерии при оценке безвредности испытуемых штаммов.

9.1.1. Испытуемый штамм не может быть признан вакцинным, если он в соответствующих дозах при всех равных условиях вызывает у морских свинок чаще более выраженные или менее доброкачественные изменения (см. ниже), чем контрольный штамм EV.

    9.1.2. Вакцинный  штамм,  введенный  морским  свинкам  в дозах

      7           9

1 x 10  и   1 x 10  м.к.,     вызывает     максимальное   развитие

островоспалительных изменений примерно к 7-м суткам, их стихание с

преобладанием  продуктивного  компонента к 10-12 суткам  и  полной

резорбцией  или заживлением  без грубых рубцовых изменений к концу

срока наблюдения (30-45 сутки).

                                                     2

    9.1.3. При  введениии  культуры в малой дозе  (10  м.к.) сроки

нарастания  и   стихания   острых  признаков  могут  затягиваться,

соответственно, до 14 и 21 суток.

9.1.4. Обнаруженные при малом и среднем увеличениях микроскопа типичные скопления чумных микробов в воспалительных очагах, вне их и внутри сосудов, даже очень мелкие и единичные, считаются абсолютно недопустимым признаком.

9.2. При введении морским свинкам культуры безвредного вакцинного штамма допустимы перечисленные ниже изменения.

    9.2.1. Место введения.  Макроскопическая картина. При введении

                                            2    7          9

культуры   вакцинного  штамма  в   дозах  10 , 10  и  2 x 10  м.к.

допустимо: незначительное  или  умеренное  диффузное  или очаговое

полнокровие  тканей  в  остром  периоде процесса (до 10-12 суток);

ограниченные  участки  полнокровия  крупных  вен, немногочисленные

кровоизлияния, полностью разрешающиеся к 30-м суткам.

                                         9

    При введении культуры  в дозе  2 x 10  м.к.  преимущественно в

остром периоде (7-10-е сутки)  не  более чем в  половине   случаев

также допустимы: участки воспалительного уплотнения  (инфильтраты)

размерами  до  1,0x1,5 см,  в  отдельных  случаях  более  крупные;

серозное   воспалительное  пропитывание  ("отек")  тканей  бедра и

паховой области на месте введения культуры, но без распространения

отека  на   прилежащие   области   (брюшная   и  грудная   стенка,

контрлатеральная  паховая  область),  очаги гнойной инфильтрации и

кровоизлияния    диаметром  до  0,5 см.  В  единичных случаях  (не

более 3)  допустимы:   крупные  кровоизлияния;  очаги  некроза  до

0,5-0,7 см в диаметре; осумкованные и инкапсулированные абсцессы с

гнойной полостью  до  0,5 см  в  диаметре; язвы  и свищи с гнойным

отделяемым.

Все вышеуказанные изменения в основном должны разрешаться к 30-м суткам. Допустимы незначительные остаточные явления (фиброз, небольшие рубцовые изменения) у единичных животных через 45 сут.

                                                7

    При введении  испытуемой  культуры в дозе 10  м.к. у отдельных

(3-5)  животных   допустимы:  участки  воспалительного  уплотнения

(инфильтраты)   размерами    не   более    0,5-0,7 см;   умеренный

воспалительный  "отек"  бедра  и паховой области с той же стороны;

очаги ограниченной гнойной инфильтрации без расплавления тканей  и

кровоизлияния до 0,5 см в диаметре у единичных животных (1-3).

                                                  2

    При  введении испытуемой  культуры  в дозе  10  м.к. допустимы

только изменения,  возможность  возникновения  которых  описана  в

начале  параграфа.  Следует   обращать  внимание  на   возможность

возникновения  осумкованных и инкапсулированных абсцессов в тканях

в  месте  введения в поздние  сроки (до 45 сут.), такие  изменения

характерны    для    недостаточно   аттенуированных   штаммов,   и

возникновение  их  недопустимо при введении исследуемой культуры в

       2

дозе 10  м.к.

    Гистологические изменения. При введении  культуры исследуемого

штамма   во   всех  указанных   дозах   допустимы:  воспалительные

инфильтраты  из  лейкоцитов (ПМН-лейкоцитов);  накопление истинных

эозинофилов  здесь,  а также в  других  воспалительных  очагах  не

является недопустимым признаком; участки  грануляционной ткани без

гнойной   инфильтрации   и   расплавления,  в т.ч.  рубцующейся  у

половины  всех  взятых  в  опыт  животных.  При  введении культуры

                               2

исследуемого  штамма  в дозе 10  м.к.  указанные  изменения  могут

наблюдаться у единичных животных (2-3).

    Кроме того, при  введении культуры исследуемого штамма в дозах

      7      9

1 x 10 -2 x 10  м.к.   не  более  чем  у половины опытных животных

допустимы: инфильтраты  со значительным  участием  ПМН-лейкоцитов;

умеренно    выраженное    распространенное    серозное,   серозно-

геморрагическое  и   гнойно-геморрагическое   пропитывание тканей;

очаги   некроза  и  гнойного  расплавления  или  инкапсулирующиеся

абсцессы, в т.ч. с признаками разрешения в  отдельных случаях  (не

более,  чем  у  3-5 животных);  гистологические  признаки  наличия

свищного  хода  или  язвы,  в  том числе в стадии заживления могут

наблюдаться  у  единичных  животных  (1-3);  при введении культуры

                                  7

исследуемого  штамма  в  дозе   10  м.к.  допустимо  возникновение

изменений, указанных выше.

9.2.2. Регионарные лимфатические узлы (паховые и подвздошные).

Макроскопическая картина.

При введении культуры испытуемого штамма во всех указанных дозах допустимо: - незначительное или умеренное (до 0,5 см в диаметре) увеличение узлов, с гиперемией и уплотнением преимущественно в остром периоде, значительное (более 0,5 см) увеличение лимфатических узлов воспалительного характера с уплотнением, гиперемией, вовлечением окружающей клетчатки (периаденит) с умеренным воспалительным "отеком", без значительной геморрагической и гнойной инфильтрации, расплавления и некрозов - не более чем у половины опытных животных преимущественно в остром периоде процесса.

    Гистологические изменения. При введении  культуры исследуемого

штамма  во  всех  указанных   дозах   допустимы: острый   серозный

(негнойный)  лимфаденит  со  слабо  выраженным  периаденитом   без

некротических   изменений;   подострый   лимфаденит  с   участками

грануляционной ткани,  чисто продуктивными  изменениями, частичным

фиброзом,  изредка  с небольшими  рассасывающимися гранулемами без

очагов  некроза  и  нагноения  в  половине  случаев  при  введении

                          9         7

культуры  в  дозах  2 x 10  и 1 x 10  м.к. и,  в отдельных случаях

                  2

(3-5), при дозе 10  м.к.

                                                   9

    Кроме того, при введении культуры в дозе 2 x 10  м.к. и иногда

  7

10  м.к.  допустимы  острый  очаговый  серозно-гнойный  и  гнойный

лимфаденит без значительных геморрагических проявлений, некрозов и

гнойного расплавления у 30% опытных животных; острый или подострый

гнойный лимфаденит с  небольшими единичными в  срезе (1-3) очагами

некроза, перифокальной реакцией,  формированием гранулем, в т.ч. с

"псевдоабсцессами" <*>, в отдельных  случаях (3-5); при введении в

         2

дозе в 10  м.к.  очаговый серозный лимфаденит с единичными в срезе

чисто продуктивными гранулемами в единичных случаях (1-2).

--------------------------------

<*> Псевдоабсцессы - это скопление в период резорбции полиморфноядерных лейкоцитов в центральной части гранулем, формирующихся в процессе иммуногенеза. Морфологически эти участки могут напоминать микроабсцессы, но отличаются от последних своим генезом и исходом.

 

    9.2.3. Контрлатеральные   и  отдаленные   лимфатические  узлы.

Макроскопическая картина. При введении  культуры во всех указанных

дозах    допустимо:   умеренное   или  незначительное   увеличение

лимфатических узлов без признаков острых воспалительных изменений.

                                               9

Кроме того, при введении культуры в дозе 2 x 10  м.к. возможно   в

отдельных   (3-5)  случаях   уплотнение   лимфатических   узлов  с

проявлением умеренной гиперемии кожных покровов.

    Гистологические  изменения.  При   введении  культуры  во всех

указанных дозах допустимы: гиперпластические изменения  лимфоидных

элементов  разной степени выраженности; умеренно или незначительно

выраженный  очаговый  серозный   лимфаденит,   небольшие   участки

продуктивных  изменений  и  фиброза  стромы  узлов,  при  введении

                        9

культуры   в дозе 2 x 10  м.к.  у  половины  опытных  животных при

инокуляции  культуры  вакцинного  штамма в других  рекомендованных

дозах, подобные изменения могут наблюдаться у 30% животных.

    9.2.4. Селезенка.   Макроскопическая   картина.  При  введении

исследуемых  культур во  всех указанных дозах допустимы: небольшое

или умеренное  (в 1,5-2 раза)  увеличение  размеров  селезенки   с

умеренным   полнокровием  при  отсутствии значительного соскоба на

разрезе (чрезмерно сочные отпечатки  при посевах) в половине,  при

                                  9

введении  культуры  в  дозе 2 x 10  м.к.  30%  животных;  признаки

гиперплазии фолликулов (выбухание под капсулой).

                                                            9

    Кроме   того,   при   введении  культуры в  дозе  2 x 10  м.к.

допустимы:  у  отдельных  морских   свинок  (не более 6)  возможно

развитие  единичных  или  немногочисленных  (не более 10 в органе)

преимущественно   субмилиарных  или отдельных  милиарных   узелков

серовато-белого,   иногда    розоватого    цвета   без   признаков

некротизации, абсцедирования, без слияния  в более крупные  очаги,

без инкапсуляции и грубого рубцевания,  полностью разрешающихся  к

                                                                7

30-м суткам;  при  введении  исследуемой   культуры  в  дозах 10 и

  2

10  м.к. возможно у отдельных  животных  (1-2)  развитие единичных

узелков (1-3)  без  признаков   некротизации,  без  абсцедирования

слияния   в   более   крупные  очаги, без  инкапсуляции  и грубого

рубцевания, полностью разрешающихся к 3-м суткам.

    Гистологические  изменения.   При  введении всех указанных доз

допустимы:  гиперплазия  клеток   белой   пульпы   (фолликулов   и

периартериальных  муфт),  плазмоклеточная  реакция разной  степени

выраженности;  полнокровие  синусов  селезенки;  острый   серозный

(негнойный)  очаговый  или  диффузный  спленит,  в  поздние  сроки

стихающий,  лимфогистиоцитарные  инфильтраты  в  строме, небольшие

участки  грануляционной  ткани  чисто   продуктивного   характера,

остаточные   явления  в  виде  небольших  участков незначительного

фиброза  в строме  и капсуле  органа при  введении культур в дозах

      9     7                                              2

2 x 10  и 10  м.к. - у 50% животных, при введении в дозе 10   м.к.

- у отдельных (3-5) животных.

                                                                 9

    Кроме того, при введении  исследуемой культуры в  дозе 2 x 10

м.к.    допустимы:   гранулемы    единичные    (1-2)    в   срезе,

преимущественно микроскопические, эпителиоидноклеточные без очагов

некроза  и   явного  абсцедирования,   без   грубого рубцевания по

периферии,  иногда  с   небольшим  накоплением   полиморфноядерных

лейкоцитов  ("псевдоабсцесс") при процессах резорбции не более чем

у 5-6  опытных животных;  при введении исследуемой культуры в дозе

  7

10  м.к.   допустимы   у  единичных    животных   гранулемы  (1-2)

продуктивного   характера,    единичные   в   срезе,   мелкие   до

субмилиарных.

9.2.5. Печень. Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во всех указанных дозах допустимы: признаки умеренных диффузных дистрофических изменений органа (некоторое увеличение размеров, набухание, сероватый оттенок окраски); венозное полнокровие, иногда неравномерное; у единичных (1-2) опытных животных возможно развитие до 3 узелков в органе, преимущественно точечных без признаков некроза, нагноения и грубого рубцевания чисто продуктивного характера; беловатые или сероватые точечные и штрихообразные очаги, просвечивающие под капсулой, единичные (1-3) в органе у 1-3 животных.

    Кроме   того,  при  введении   исследуемой   культуры  в  дозе

      9

2 x 10  м.к.   допустимы:   у  отдельных   животных   (не более 6)

немногочисленные (до 10)  преимущественно точечные и субмилиарные,

редко   милиарные   узелки   без   признаков   некротизации,   без

абсцедирования,  инкапсуляции и  грубых  рубцовых изменений  ткани

печени    в   поздние   сроки,   иногда   с  небольшими втяжениями

                                                          7

поверхности; при  введении  исследуемой культуры в дозе 10  м.к. у

единичных    (1-3)   животных   возможно   развитие   точечных   и

сублимационных   узелков   без    признаков    некротизации,   без

асцедирования,  без инкапсуляции и грубых рубцовых изменений ткани

органа.

Гистологические изменения. При введении исследуемой культуры во всех указанных дозах у 50% животных допустимы: умеренно выраженная зернистая, зернисто-вакуольная дистрофия, часто неравномерная; небольшие участки умеренной жировой дистрофии; мелкие, в пределах 10-15 печеночных клеток лимфогистиоцитарные инфильтраты в строме, единичные (2-3) в срезе.

                                                            9

    При    введении   испытуемой  культуры   в   дозе 2 x 10  м.к.

допустимы:  гранулемы  эпителиоидно-клеточные без фокусов некроза,

абсцедирования,   инкапсуляции,   выраженных  рубцовых  изменений,

преимущественно микроскопических и субмилиарных  размеров, изредка

до милиарных, с  признаками резорбции, не более чем  у 6 животных;

единичные  (1-3)   в   срезах  микроскопические  очаги  некроза  и

некробиоза в пределах 10-15 печеночных  клеток  при наличии хорошо

выраженной   продуктивной   клеточной  реакции  без  склонности  к

дальнейшей   некротизации  и  абсцедирования  у единичных животных

                                                   7

(1-2); при введении исследуемой  культуры в дозе 10  м.к. возможны

единичные в срезе (1-2) гранулемы чисто продуктивного характера  у

единичных (1-2) животных; при введении исследуемой культуры в дозе

  2

10  м.к. допустимы  единичные (1-2) микроскопические  продуктивные

гранулемы  единичные  (1-2) в  отдельных  срезах у единичных (1-2)

животных.

9.2.6. Легкие. Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во всех дозах допустимы: участки неравномерного полнокровия легких; участки пониженной воздушности серовато-синюшного цвета.

                                                            9

    При   введении  исследуемой  культуры   в  дозе   2 x 10  м.к.

допустимы:  милиарные  и субмилиарные  очаги  уплотнения  легочной

ткани   серовато-розоватого,    иногда   синюшно-красного   цвета,

немногочисленные  (до 10 в обоих легких) в  половине  случаев  при

отсутствии бактериологического выделения возбудителя чумы из ткани

                                                      7     2

легких;  при  введении исследуемой культуры в дозах 10  и 10  м.к.

возможно развитие единичных (1-3) милиарных и субмилиарных  очагов

уплотнения  легочной  ткани у единичных (1-3) опытных животных при

отсутствии позитивных бактериологических данных.

    Гистологические  изменения.  При введении  всех указанных  доз

допустимы:   признаки    умеренной    очаговой    интерстициальной

инфильтрации   (преимущественно   гиперпластического    характера)

перегородок   между   альвеолами   лимфоидными  и  гистиоцитарными

клеточными  элементами  при отсутствии  сужения просветов альвеол,

кровоизлияний, значительной примеси в инфильтрате  ПМН-лейкоцитов,

гиперплазии  бронхопульмонарных  лимфатических   узелков,  крупных

лимфогистиоцитарных  инфильтратов  вокруг  сосудов  и бронхов. При

                                                 9

введении   испытуемой   культуры  в  дозе  2 x 10  м.к. допустимы:

вышеописанные   изменения    преимущественно    гиперпластического

характера  типа  интерстициальной  реакции  распространенного  или

диффузного характера с  участием бронхопульмональных лимфатических

узелков,  наличием  лимфогистиоцитарных   инфильтратов   умеренных

размеров вокруг сосудов и бронхов.

9.2.7. В других органах (сердце, почки, надпочечники) допустимы гиперпластические и умеренные дистрофические изменения в пределах, наблюдаемых при обычном вакцинном процессе после введения культуры эталонного штамма EV.

    Все   вышеотмеченные   изменения,   допустимые  при   развитии

вакцинальной  реакции,  могут  колебаться   в известных пределах у

отдельных   морских  свинок  по   выраженности,  срокам развития и

полноте  резорбции. Оценка изменений в месте введения культуры и в

лимфатических  узлах  в смысле их допустимости как вакцинальных не

представляет трудности. В противоположность  этому дать правильную

оценку  изменениям во внутренних органах, укладывающимся в пределы

вакцинальных реакций, очень сложно. Возникают затруднения даже при

подсчете  числа  узелков  в  печени и селезенке. Иногда количество

узелков  может быть решающим  в оценке испытуемых культур. Наличие

12-15 узелков  в  печени и селезенке у 1-2 морских свинок, которым

                                                       9

испытуемая    культура   была   введена   в дозе 2 x 10  м.к., при

отсутствии  других недопустимых изменений не может быть абсолютным

показателем для ее отклонения.

9.3. Отсутствие или слабая выраженность дистрофических процессов в паренхиматозных органах, отсутствие роста испытуемого штамма чумного микроба в посевах из этих органов наряду с другими позитивными характеристиками штамма указывают на безвредность последнего, несмотря на несколько большую узелковую реакцию. В то же время единичные узелки (2-5), заканчивающиеся формированием абсцессов и рубцов, приводящие к нарушению структуры органа, могут быть показателем высокой степени остаточной вирулентности изучаемой культуры, и на основании этого штамм может быть поставлен под сомнение как соответствующий вакцинному.

Наиболее важное значение имеет качество узелков: их характер, развитие и исходы. Узелки должны развиваться в острой, нестерильной фазе поствакцинальной реакции, иметь продуктивный характер. В период резорбции приобретать строение псевдоабсцессов и рассасываться к 30-45-м суткам наблюдения, когда наступает полное восстановление структуры органов.

Формирование узелков в печени и селезенке может сочетаться с выраженными местными изменениями. Опыт показывает, что это наблюдается чаще. Однако в ряде случаев узелки обнаруживаются у морских свинок, у которых в месте введения культуры и регионарных лимфатических узлах изменения минимальные. Образование очагов некробиоза в печени, по-видимому, обусловлено токсигенными свойствами, которые сохраняют вакцинные штаммы чумного микроба и при введении в максимальной дозе эти свойства микробов иногда проявляются.

    9.4. Недопустимо  при подкожном введении даже при максимальной

            9

дозе (2 x 10  м.к.) испытуемого   вакцинного  микроба  развитие  в

месте   введения  обширных кровоизлияний  в  подкожной клетчатке с

выраженным  отеком,  гнойным  расплавлением или некрозом тканей; в

регионарных  лимфатических узлах - диффузного  гнойного  аденита и

периаденита  с  видимыми  участками  некроза;  в  легких - сливных

очагов  интерстициальной  пневмонии  или  микроскопических  очагов

серозной;  серозно-геморрагической   и  катаральной   пневмонии  с

выделением из легких испытуемой  культуры; в  печени и селезенке -

множественных   узелков  и  очагов  некроза,  абсцессов,  обширных

кровоизлияний, а в поздние сроки - рубцовых изменений.

Все вышеизложенное позволяет считать, что изучение в динамике морфологических изменений в тканях и органах морских свинок, которым была введена испытуемая культура в максимальной дозе, дает возможность подойти к решению очень важных вопросов: о степени остаточной вирулентности и реактогенности культуры, полноценности взятых в опыт животных. Кроме того, при введении культуры вакцинного штамма в минимальной дозе может выявиться неоднородность клеточной популяции аттенуированного штамма.

 

10. Определение безвредности и реактогенности

испытуемого штамма при аэрогенной иммунизации

морских свинок

 

Аэрогенная вакцинация против чумы, особенно против легочной формы этой инфекции, является высокоэффективным методом, имеющим ряд преимуществ перед накожными, подкожным и внутрикожным путями введения вакцины. Методика определения безвредности вакцинного штамма чумного микроба при аэрогенной иммунизации морских свинок приведена в прилож. 4.

10.1. Определение приживаемости и распространяемости бактерий испытуемого и вакцинного штаммов чумного микроба.

Для вакцинного штамма чумного микроба при аэрогенном методе введения допустимо выделение чумного микроба: из легких у всех животных с 1-х до 14-х суток; из регионарных (бифуркационных) и других лимфатических узлов до 14-х суток; из печени и селезенки у единичных животных в течение 7 сут. Допустимо выделение единичных бактерий испытуемого вакцинного штамма чумного микроба в первые 1-3 сут. из крови. Недопустимо выделение бактерий испытуемого штамма из органов и лимфатических узлов чаще и в более длительные сроки после введения, чем эталонного вакцинного штамма EV.

10.2. Определение реактогенности штамма для морских свинок при аэрогенном способе введения.

Реактогенность штамма при аэрогенном способе введения оценивают по изменению массы и температуры тела опытных животных.

Иммуногенный вакцинный штамм чумного микроба при аэрогенной иммунизации может вызывать снижение массы морских свинок, но не более чем на 5% от первоначальной величины. К 7-м суткам масса животных должна восстанавливаться. Температура тела морских свинок в течение недели после иммунизации может повышаться. Среднее повышение температуры для группы животных, иммунизированных культурой испытуемого штамма, не должно существенно превышать наблюдаемое при иммунизации культурой эталонного вакцинного штамма (для групп животных в среднем увеличение температуры не должно превышать 1,5 град. C).

10.3. Определение безвредности штамма по морфологическим показателям при аэрогенном способе введения.

При ингаляционном способе введения испытуемого штамма микробы попадают в верхние дыхательные пути и в легкие, поэтому морфологические изменения раньше развиваются в легких, чем в других внутренних органах. При ингаляционной иммунизации живыми чумными микробами при гистологическом исследовании в легких наблюдается развитие продуктивной межуточной реакции в межальвеолярных перегородках, гиперпластических процессов в перибронхиальных, периваскулярных лимфоидных образованиях, сочетающихся с увеличением в клеточных элементах количества РНК.

10.3.1. Допустимые изменения.

В легких допустимы межуточная продуктивная реакция, при которой имеется инфильтрация межальвеолярных перегородок гистиоцитами, лимфоцитами, эпителиоидными клетками и макрофагами без резкого сдавления просветов альвеол, наличие в легких эпителиоидноклеточных гранулем (не более 10-15 в обоих легких).

В регионарных лимфатических узлах допустимы гиперпластические процессы различной степени выраженности, образование эпителиоидноклеточных гранулем (до 6), трансформация единичных гранулем в псевдоабсцессы без выраженных явлений некроза в них. В селезенке - гиперпластические процессы и образование эпителиоидноклеточных гранулем (не более 10), большая часть которых не должна превращаться в псевдоабсцессы. В печени допустимы умеренно выраженные дистрофические изменения паренхиматозных элементов, диффузная или мелкоочаговая пролиферация купферовских клеток и образование эпителиоидноклеточных гранулем (до 10), превращение в псевдоабсцессы лишь некоторых гранулем.

Почки, надпочечники, сердце - допустимы умеренные дистрофические изменения паренхиматозных элементов этих органов.

10.3.2. Недопустимые изменения. Недопустимы в легких диффузная или крупноочаговая межуточная реакция с резким сдавлением просветов альвеол клеточными инфильтратами, наличие больших количеств нейтрофильных лейкоцитов среди клеток межальвеолярных перегородок; множественные, хотя бы и мелкие очаги (в 5 и более альвеол) катарально-десквамативной пневмонии; образование более 10 гранулем и превращение их в псевдоабсцессы, катарально-геморрагические пневмонии, гнойные трахеиты и бронхиты, абсцессы, множественные очаговые или сливные кровоизлияния, распространенные перибронхиальные и периваскулярные склерозы.

В регионарных лимфатических узлах недопустимо развитие гнойного аденита и периаденита; наличие массивных кровоизлияний, артериолонекрозов, образование более 5 гранулем с преимущественной их трансформацией в псевдоабсцессы и с выраженными явлениями некроза. В селезенке недопустимо образование более 10 гранулем и превращение их в псевдоабсцессы, гнойные сплениты, абсцессы, очаги некроза, обширные кровоизлияния. В печени недопустимы резко выраженные дистрофические изменения, доходящие до образования крупных (более 10 клеток) фокусов некроза, абсцессы, гнойные гепатиты, массивные кровоизлияния, большое количество гранулем (более 10) и их превращение в псевдоабсцессы.

 

11. Оценка реактогенности испытуемого штамма

по стрессорному действию

 

Стрессорное действие культуры вакцинного штамма оценивают по уровню в периферической крови кортикостероидных гормонов и их фракций, методика определения которых описана в прилож. 5.

                                                            7

    Вакцинный штамм чумного микроба EV, введенный  в дозе 10  м.к.

через 1 сут. после введения  обычно обуславливает у морских свинок

повышение   общих 11-ОКС  в  2  раза,  свободных - в 2,3-2,5 раза,

белковосвязанных - 1,7-2,0 раза. Коэфициент отношения биологически

активных  фракций  к  белковосвязанным не  превышает 1. Испытуемый

штамм,   предлагаемый   в   качестве   вакцинного,  не  должен  по

стрессорному  действию  вызывать  более  выраженное  действие, чем

контрольный эталонный штамм чумного микроба EV.

 

12. Определение влияния испытуемого штамма

на иммунную систему морских свинок

 

Цель проведения испытания заключается в выявлении возможных иммунологических нарушений в организме после введения культуры исследуемого штамма. Нарушения иммунной системы могут приводить к развитию вторичного иммунодефицита, быть причиной изменений иммуногенной реактивности организма на другие неродственные антигены, лежать в основе неполноценного специфического ответа на сам штамм. Методы определения действия вакцинного штамма на иммунную систему приведены в прилож. 6.

                                                        5

    12.1. Испытуемый штамм чумного микроба в дозе 1 x 10  м.к. при

подкожном   введении   морским   свинкам   не   должен   оказывать

повреждающее  действие  на   иммунную   систему: должен   вызывать

умеренное  повышение   (в 1,5-2,0 раза)   количества   лимфоцитов,

находящихся  в  S+G2+M  фазах  клеточного  цикла, статистически не

отличающиеся от показателя наблюдаемого для вакцинного  штамма EV.

    12.2. Введение   в   макроорганизм   митогена   или   антигена

индуцирует   пролиферацию  лимфоцитов,  т.е. деление  этих клеток.

Предполагается  прямая  зависимость  между  степенью  выраженности

специфической  трансформации   лимфоцитов  в  условиях  in   vitro

(показатель РБТЛ)   и   проявлением    специфического   клеточного

иммунного  ответа  на  данный антиген. Индекс  стимуляции  реакции

бласттрансформации  лимфоцитов  (ИС РБТЛ) для  испытуемого  штамма

должен  быть  в 1,5-3 раза  выше  с лимфоцитами  морских   свинок,

                       5

иммунизированных 1 x 10  м.к., чем  для  интактных  лимфоцитов под

воздействием     неспецифических    митогенов   и   ультразвуковых

дезинтегрантов  (УЗД) чумного микроба. Уровень стимуляции РБТЛ для

испытуемого  штамма  не должен  быть  статистически  значимо  ниже

ИС РБТЛ для вакцинного штамма EV.

    12.3. Цитотоксический индекс (ЦТИ)  у морских свинок, привитых

               5

подкожно 1 x 10  м.к.  испытуемого  штамма,  не  должен  быть ниже

показателя ЦТИ, чем  у привитых  эталонным  вакцинным  штаммом EV.

                                                            5

    12.4. Макрофаги морских свинок, привитых подкожно 1 x 10  м.к.

испытуемого  штамма,  не  должны иметь   более  низкие  показатели

процента  фагоцитирующих  клеток  (ПФ) и фагоцитарного числа (ФЧ),

определяемого   количеством  фагоцитированных   микробов  на  один

фагоцит, а также абсолютного фагоцитарного показателя (АФП), чем у

привитых этой же дозой эталонного вакцинного штамма EV.

    12.5. Испытуемый  вакцинный   штамм   чумного  микроба  в дозе

      5

1 x 10  м.к. не   должен подавлять развитие клеточного (по реакции

гиперчувствительности замедленного типа) и гуморального  (по числу

антителообразующих клеток к эритроцитам барана) иммунного  статуса

у белых мышей на  гетерологичные антигены. Допускается минимальное

снижение  иммунного ответа, но не большее  чем при введении в этой

дозе  эталонного   вакцинного  штамма  EV.   Методика  определения

приведена в п. 7 прилож. 6.

 

13. Иммуногенная активность штамма

 

Вакцинный штамм чумного микроба должен предохранять морских свинок от подкожного и аэрогенного заражения, а белых мышей - от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба и индуцировать формирование у животных иммунитета достаточной напряженности и длительности. Методики определения иммуногенной активности вакцинного штамма приведены в прилож. 7.

    13.1. Величина   ЕД50,   рассчитанная   для   контрольного   и

исследуемого   штаммов, не  должна  превышать  для морских  свинок

      3                                4

1 x 10 ,    для   белых   мышей  1 x 10  м.к.    По   протективной

эффективности  испытуемый штамм считают  равноценным  контрольному

вакцинному,   если   его   минимальный   показатель ЕД50 не  более

максимального   показателя    эталонного   вакцинного  штамма  EV.

Испытуемый  штамм  можно  считать  более  иммуногенным,  если  его

максимальный показатель ЕД50 меньше  минимального  показателя ЕД50

контрольного штамма.

13.2. Минимальная иммунизирующая доза соответствует наименьшему количеству микробов, способных индуцировать формирование специфического иммунитета, обеспечивающего выживание не менее чем 80% животных, вакцинированных этой дозой и зараженных на 21-е сутки 200 DCL (Dosis certae letalis) вирулентного штамма чумного микроба.

    Минимальная   иммунизирующая   доза   штамма  EV линии НИИЭГ и

испытуемого  штамма  для   морских  свинок  не  должна   превышать

      3

5 x 10  м.к. двухсуточной агаровой культуры.

    13.3. Вакцинный  штамм  при  иммунизации морских свинок в дозе

      3

5 x 10  м.к. и подкожном  заражении  культурой вирулентного штамма

чумного  микроба в  дозе 200 DCL уже на 7-ой день  после  прививки

должен предохранять от гибели не менее 50% привитых животных.

    13.4. Напряженность  иммунитета  определяется  по  способности

вакцинного штамма предохранять  животное от гибели после заражения

массивной   дозой  вирулентной  культуры Y. pestis.  Напряженность

иммунитета  выражается  числом   микробных  клеток,  при заражении

которыми  на 21-е   сутки погибает (LD  )  50%   морских   свинок,

                       3              50

иммунизированных 5 x 10  м.к.  и  белых  мышей,   иммунизированных

  4

10  м.к., а также индексом иммунитета.

Индекс иммунитета - отношение величины LD50 в м.к., рассчитанной для вакцинированных животных к аналогичному показателю, рассчитанному для интактных животных.

Напряженность иммунитета, создаваемого культурой испытуемого вакцинного штамма, не должна быть меньше аналогичного показателя, полученного на животных, вакцинированных культурой вакцинного штамма EV, то есть величины LD50 и индекса иммунитета, рассчитанные для испытуемого штамма, не должны быть ниже, чем аналогичные показатели, рассчитанные для контрольного эталонного штамма. При сравнении вышеуказанных показателей, расчитанных для контрольного штамма EV и для исследуемого вакцинного штамма, учитывается только статистически достоверная разница.

    13.5. Испытуемый  штамм  чумного  микроба,  введенный  в  дозе

      3

5 x 10  м.к.,  должен  вызывать  у  морских  свинок  иммунитет, по

длительности  не уступающий иммунитету,  создаваемому той же дозой

вакцинного штамма EV.

    13.6. Эталонный вакцинный и испытуемый штаммы  должны защищать

от   чумы   не   менее   8 из 10  морских свинок, иммунизированных

                  6

аэрогенно 2-8 x 10  колониеобразующих клеток.

 

14. Испытания стабильности штамма в

производственных условиях

 

Испытуемый штамм, удовлетворяющий по результатам доклинических испытаний требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам чумного микроба, следует проверить на стабильность свойств в производственных условиях.

Вакцинные штаммы чумного микроба не должны изменять свои культурально-морфологические, биохимические и иммуногенные свойства при испытании на стабильность путем двукратного выращивания при аэрации в бульоне; должны давать в производственных условиях изготовления вакцины хорошую урожайность, жизнеспособность, стабильность суспензии, высокую активность готового препарата живой сухой вакцины.

Контроль трех первых серий вакцины чумной живой сухой, приготовленной из нового штамма, должен проводиться в соответствии с нормативной документацией на готовый препарат вакцины чумной живой сухой и удовлетворять требованиям нормативной документации, определяющим ее качество.

 

15. Испытания вакцины чумной сухой на людях

 

Разрешение на апробацию лабораторных серий экспериментальной вакцины из нового штамма на реактогенность, безопасность и специфическую активность на ограниченной группе людей дает Министерство здравоохранения Российской Федерации по представлению Комитета МИБП. Для возбуждения ходатайства об испытании вакцины на добровольцах необходимо:

15.1. Обсудить на Ученом Совете НИИ отчет о доклинических лабораторных испытаниях, результаты контроля в соответствии с фармакопейной статьей трех экспериментальных серий вакцины чумной живой сухой из нового штамма, проект программы ограниченных испытаний.

15.2. Представить в Комитет МИБП ходатайство о разрешении испытаний на добровольцах экспериментальной вакцины из нового штамма, акт государственной комиссии о лабораторных доклинических испытаниях этого штамма, результаты контроля ОБТК трех первых серий вакцины в соответствии с ФС на коммерческую вакцину, решение Ученого Совета НИИ, результаты авторских лабораторных испытаний; в ГИСК им. Л.А.Тарасевича - трех первых экспериментальных серий препарата.

15.3. ГИСК им. Л.А.Тарасевича направляет в Комитет МИБП решение Ученого Совета о целесообразности испытания на добровольцах вакцины из нового штамма, заключение о качестве трех экспериментальных серий.

15.4. Комитет МИБП рассматривает все материалы о новом вакцинном штамме чумного микроба (результаты авторских испытаний, заключение государственной комиссии, заключение ГИСК им. Л.А.Тарасевича, программу испытаний) и направляет свою рекомендацию в Министерство здравоохранения РФ.

15.5. Испытуемый штамм чумного микроба, удовлетворяющий всем перечисленным требованиям, прошедший с положительным заключением государственные испытания, может признан как вакцинный, утвержден Министерством здравоохранения РФ.

15.6. Дальнейшая апробация вакцины из нового штамма на людях проводится в общем порядке, установленным Министерством здравоохранения РФ для внедрения новых бактерийных и вирусных препаратов санитарными правилами "Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов" (СП 3.3.2.561-96).

 

 

 

 

 

Приложение N 1

(обязательное)

 

МЕТОДИКИ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА

ПО ВИДОВЫМ ПРИЗНАКАМ

 

1. Определение чувствительности штамма к чумному

диагностическому бактериофагу Л-413С

 

Суточную культуру испытуемого штамма засевают "газоном" на поверхность агара в чашке Петри и наносят "дорожкой" каплю диагностического чумного бактериофага Л-413С. Посев инкубируют при температуре (28 +/- 1) град. C. Учет результатов проводят через 24-48 ч. На чашках с чувствительными к фагу культурами Y. pestis образуются характерные зоны лизиса.

Исследуемый вакцинный штамм чумного микроба должен лизироваться бактериофагом чумным Л-413С.

 

2. Способность бактерий ферментировать сахара и спирты

 

Определяют на средах Гисса по общепринятой методике или с использованием специальных тест-систем импортного или отечественного производства в соответствии с Инструкциями по их применению.

 

3. Определение продукции капсульного антигена FI

 

    Проводят  путем  постановки реакции  непрямой  гемагглютинации

(РИГА).  В  8  лунок  полистироловой  пластины  вносят  по  0,4 мл

раствора  твина-80 в разведении  1:50000 или другого стабилизатора

(нормальную кроличью или лошадиную сыворотку  в разведении 1:100).

В первую  лунку   добавляют  0,4 мл  культуры   чумного   микроба,

выращенной   на  обогащенной  питательной  среде  при  температуре

(37 +/- 1) град. C в течение 48 ч. и  инактивированной формалином,

                      6

в  концентрации 1 x 10  м.к.  в  1 мл,   делают   последовательные

двукратные  разведения переносом по 0,4 мл из одной лунки в другую

до 7-ой лунки включительно,  из которой 0,4 мл удаляют.  8-я лунка

используется  для  контроля   диагностикума.  Затем  во все  лунки

добавляют по  одной капле (0,05 мл)  диагностикума эритроцитарного

чумного иммуноглобулинового 2,5%-ой концентрации. Содержимое лунок

перемешивают покачиванием пластины; пластину оставляют на 18-24 ч.

при   температуре   (22 +/- 4) град. C,   после   чего   учитывают

результат.   Результат  считают  положительным,  когда  эритроциты

выпадают  на  дно лунок равномерным слоем,  занимая  не  менее 2/3

сферической поверхности,  иногда отмечается фестончатое  оплывание

края  агглютината.  В  случае  отрицательного   результата    РНГА

эритроциты  выпадают  на  дно  лунок в  виде "пуговки"  или узкого

колечка с ровным краем как в контроле. При оценке чувствительности

РНГА  концентрацию культуры чумного микроба в 1-ой лунке принимают

             5

равной 5 x 10  м.к. в 1 мл.

 

4. Определение популяционного состава культуры

исследуемого вакцинного штамма Y. pestis

по признаку кальцийзависимости

 

4.1. Методика приготовления магний-оксалатного агара

 

Необходимо заранее приготовить следующие компоненты и маточные растворы: 2%-ный питательный агар на основе ферментативного гидролизата мяса (аминного азота - 110 +/- 10 мг %, натрия хлористого - 5,0 г/л, калия хлористого - 0,2 г/л). Натрий фосфорно-кислый двузамещенный в среду не добавлять, т.к. фосфаты частично связывают, а затем отдают ионы кальция. pH среды до 7,0-7,2 в этом случае доводят раствором едкого натра. Готовая питательная среда стерилизуется автоклавированием при температуре 120-125 град. C 30 мин.

Для приготовления 0,25 М раствора оксалата (щавелевокислого) натрия - Na2C2O4, нужно 33,6 г соли растворить в дистиллированной воде и довести объем раствора до 1 л. Для приготовления 0,5 М раствора хлористого магния - MgCl2 x 6H2O, требуется 101,66 г данной соли на 1 л дистиллированной воды. Растворы оксалата натрия и хлористого магния разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 125 град. C 30 мин. Сульфит натрия - Na2SO3, 1%-ный спиртовый раствор генцианвиолета или метилового фиолетового не стерилизуется. Указанные растворы могут длительное время храниться при температуре 18-25 град. C.

Перед разогревом питательного агара в автоклаве текучим паром в него добавляют 80 мл/л 0,25 М раствора оксалата натрия для связывания имеющегося в питательной среде кальция. Затем уже в растопленный агар вводят 40 мл/л 0,5 М раствора хлористого магния. 0,5 г/л сульфита натрия (навеску сульфита натрия ex tempore растворяют в дистиллированной воде и кипятят 10 мин. на электрической плитке) и 1 мл 1%-ного спиртового раствора генцианвиолета. Агаровую среду с добавками тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Исследуемый материал высевают на подсушенный агар и инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 72 ч. Контрольной средой в этом случае является питательный агар с кальцием (см. ниже).

Для получения достоверных результатов рекомендуется использовать чашки с дифференциальной и контрольной питательными средами, разлитыми в день проведения работы или накануне.

 

4.2. Приготовление агара с добавлением ионов кальция

 

Питательный агар с кальцием готовят на ферментативном гидролизате мяса. Он содержит:

- аминного азота - 110 +/- 10 мг %;

- агар-агара - 30,0 г/л;

- натрия хлористого - 5,0 г/л;

- калия хлористого - 0,2 г/л;

- натрия фосфорно-кислого двузамещенного - 1,02 г/л;

- pH среды - 7,0-7,2.

Разливают питательную среду в зависимости от потребностей: во флаконы, колбы, матрацы или бутыли. Стерилизуют автоклавированием при температуре 120-126 град. C в течение 30 мин. Стерильная питательная среда хранится при температуре 18-25 град. C в течение 10 сут., при 4-6 град. C - 30 сут.

Перед розливом в чашки Петри питательный агар растапливают на водяной бане или в автоклаве текучим паром. В растопленный агар добавляют 0,5 г/л сульфита натрия, 1 мл/л 1%-ного спиртового раствора генцианвиолета или метилового фиолетового, 4-8 мл/л 250 мМ раствора CaCl2. Для приготовления маточного раствора хлористого кальция указанной концентрации навеска соли в случае использования безводного препарата (мол. масса 111,0) составляет 27,75 г/л, а в случае гидрата CaCl2 x 6H2O (мол. масса 219,09) - 54,77 г/л. Раствор хлористого кальция стерилизуют автоклавированием при температуре 125 град. C 30 мин. Хранится при комнатной температуре 30 сут. Спиртовый раствор генцианвиолета не стерилизуют, он хранится под пробкой длительное время. Раствор сульфита натрия готовят перед приготовлением чашек, растворяя 500 мг соли в 10 мл воды; стерилизуют кипячением.

 

4.3. Методика определения доли кальцийнезависимых (Cad-)

клеток в популяции микробных культур чумного микроба

 

    Для  определения    доли  кальцийнезависимых  (Cad-)  клеток в

популяции    микробных   культур   чумного    микроба   используют

двухсуточные   агаровые   культуры,   выращенные  при  температуре

(28 +/- 1) град. C.  Из  полученной  культуры  готовят   взвесь  в

0,9%-ном растворе хлорида натрия по отраслевому стандарту мутности

ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-59-86П) 10 единиц, содержащую в

           9

1 мл 1 x 10  микробных клеток.

    Высев культуры  чумного  микроба  на чашки с магний-оксалатным

                                                        -3    -4

питательным агаром производят по 0,1 мл из разведений 10  , 10   и

  -5                                                 9

10   исходной бактериальной взвеси, содержащей 1 x 10  м.к./мл, на

                                                              -5

агаровые пластинки с ионами кальция по 0,1 мл из разведений 10   и

  -6

10  . Каждое разведение следует высевать на 3 (или более)  чашки с

питательным агаром.  Посевы инкубируют при  температуре (37 +/- 1)

град.  C  в  течение  3 сут.  По  истечении   срока  инкубирования

производят подсчет колоний. На магний-оксалатном питательном агаре

вырастают   колонии   трех  типов:  крупные   (2-2,5 мм),  средние

(1,5-2 мм) и  очень мелкие (менее 1 мм). Крупные и средние колонии

формируют     клетки,      утратившие           кальцийзависимость

(кальцийнезависимые мутанты),   мелкие   состоят    из   бактерий,

отличающихся   от   типичных   клеток   по степени  зависимости от

кальция, способности синтезировать   VW  и  другие   антигены,  по

стабильности  этих признаков  и т.д.  Подсчитывают  только крупные

и средние колонии. На  агаре с кальцием формируются только крупные

колонии  (2,5-3 мм)  с  типичной морфологией, все выросшие колонии

подсчитывают.

Доля кальцийнезависимых микробных клеток в популяции исследуемой культуры выражается в процентах и определяется как отношение количества кальцийнезависимых мутантов, содержащихся в исходной суспензии, к общему числу колониеобразующих бактерий в этой суспензии. Расчет производится по следующей формуле:

 

                            nCad-

                        X = ----- x 100%, где:

                              N

 

X - процент кальцийнезависимых микробных клеток в популяции;

nCad- - количество кальцийнезависимых колоний, выросших на магний-оксалатном питательном агаре при температуре 37 град. C в течение 3 сут.;

N - количество колоний, выросших на агаре с кальцием.

Доля кальцийнезависимых мутантов в популяции культур чумного микроба, недавно пропассированных через организм лабораторных животных и не подвергавшихся длительному хранению или каким-либо физическим воздействиям, не должна превышать 0,3%.

 

5. Определение пестициногенности, фибринолитической

и плазмокоагулазной активностей

 

5.1. Определение пестициногенности

 

Для определения свойства пестициногенности культуру испытуемого штамма засевают петлей на чашки с агаром Хоттингера точками на расстоянии 2-3 см. В качестве положительного контроля используют эталонный вакцинный штамм чумного микроба EV, обладающий свойством пестициногенности. Посевы инкубируют при температуре (28 +/- 1) град. C в течение 2 сут., затем культуры в течение 10 мин. убивают парами хлороформа, после чего хорошо проветривают чашки (в течение 10 мин.). На поверхность агаровой пластинки наслаивают 4,5 мл расплавленного и остуженного до температуры 50 град. C 0,8%-ного питательного агара, в который предварительно было внесено 0,5 мл суточной бульонной культуры индикаторного штамма (например, Y.pestis 1146 или Y. pseudotuberculosis 847). Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. C. Учет результатов проводят через 24 и 48 ч. Культуры, продуцирующие пестицин, образуют четкие зоны подавления роста индикаторного штамма.

 

5.2. Определение фибринолитической

и плазмокоагулазной активностей

 

    При    изучении    фибринолитической    активности    нативную

человеческую  плазму  или  цитратную  кроличью  разводят  0,9%-ным

раствором  хлорида  натрия  1:8 или 1:10  и  разливают по 0,5 мл в

каждую  пробирку.  Готовят  взвеси  бактерий двухсуточных агаровых

культур   испытуемого   и  контрольного  штаммов  в   концентрации

      9

1 x 10  м.к./мл. По 0,25 мл взвеси исследуемого материала вносят в

пробирку  с  плазмой,  перемешивают  и добавляют 0,25 мл 0,9%-ного

раствора   хлорида натрия  и  0,1 мл 0,5%-ного   раствора  хлорида

кальция.  В  другую   пробирку  с  0,5 мл  плазмы  вносят  0,25 мл

приготовленной  взвеси   культуры Y. pestis EV и 0,1 мл  0,5%-ного

раствора   хлорида  кальция  (положительный контроль).  В   третью

пробирку,  содержащую  0,5 мл  нативной   плазмы,  вносят  0,25 мл

приготовленной  суспензии  исследуемого вакцинного штамма и 0,1 мл

0,5%-ного  раствора  хлорида   кальция.  Посевы   инкубируют   при

температуре   (37 +/- 1) град. C.  Через   40-60 мин.    проверяют

образование сгустка. Если за 60 мин. сгусток не образовался, пробу

следует повторить. В случае образования сгустка пробирки оставляют

в термостате  еще  на 18 - 20 ч.  Результаты  оценивают  следующим

образом: "4+" - полное растворение   сгустка; "3+" - почти  полное

растворение сгустка, на поверхности очень маленькая пленка; "2+" -

небольшой  сгусток  плавает  в  большом  количестве  плазмы; "+" -

хорошо сформированный сгусток в небольшом количестве плазмы; "-" -

сгусток заполняет всю пробирку (лизиса не произошло).

Испытуемый штамм должен растворять сгусток плазмы с интенсивностью, не уступающей контрольному  вакцинному штамму EV - и не менее чем на "3+".

 

6. Определение признака пигментсорбции

 

Методика приготовления синтетической питательной среды с гемином.

    Синтетическая  питательная среда с гемином  предложена Tacrson

                                  +      -

и Burrows  для  дифференциации Pgm  - Pgm  клеток чумного микроба.

Она включает  около 20  компонентов. В соответствиии  с методикой,

питательную среду готовят, смешивая в определенной  пропорции  три

ее составляющие,  которые готовят, стерилизуют и хранят раздельно:

агаровая основа, питательная основа, специальные добавки. Перечень

компонентов, входящих в каждую из них, приведен в табл. 1.

 

Таблица 1

 

Состав среды с гемином