МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

ДЕПАРТАМЕНТ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА,

ЭФФЕКТИВНОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И

МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ

 

ПИСЬМО

 

29 октября 2001 г.

 

N 291-22/144

 

Департамент государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники направляет к сведению и руководству изменение N 2 к статье Государственной фармакопеи XI издания "Методы микробиологического контроля лекарственных средств" (ГФХI, вып. 2, с. 187) и просит предусмотреть с 1 января 2002 года разделы "Микробиологическая чистота" и "Стерильность" в стандартах качества лекарственных средств, направляемых на регистрацию (перерегистрацию), в соответствии с указанным изменением.

 

Заместитель руководителя Департамента

Д.В.РЕЙХАРТ

 

 

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

ФАРМАКОПЕЙНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

 

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель руководителя Департамента

государственного контроля качества,

эффективности, безопасности

лекарственных средств и

медицинской техники

Д.В.РЕЙХАРТ

 

ИЗМЕНЕНИЕ N 2

К СТАТЬЕ ГОСФАРМАКОПЕИ XI ИЗДАНИЯ "МЕТОДЫ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ"

(ГФ ХI, вып. 2, с. 187)

 

Срок введения Изменения с 01.01.2002 г.

 

РАЗДЕЛ 1

ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЧИСТОТЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, СУБСТАНЦИЙ

И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

 

Таблица 1

 

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

 

┌──────────┬───────────────────────────┬─────────────────────────┐

│ Категория│         Применение        │ Рекомендуемые нормы для │

│          │                           │Госфармакопеи XII издания│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│    1     │             2             │            3            │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 1.       │- Для парентерального      │      Стерильность       │

│          │  введения                 │                         │

│          │- Глазные лекарственные    │                         │

│          │  средства                 │                         │

│          │- Для нанесения на открытые│                         │

│          │  раны и ожоги             │                         │

│          │- Другие лекарственные     │                         │

│          │  средства, к которым      │                         │

│          │  предъявляется требование │                         │

│          │  "стерильность"           │                         │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 2.       │- Для применения местно,   │- Общее число аэробных   │

│          │  трансдермально           │  бактерий и грибов      │

│          │- Для применения           │  (суммарно) - не более  │

│          │  интравагинально          │    2                    │

│          │- Для введения в полости   │  10  в 1 г или в 1 мл   │

│          │  уха, носа                │- Отсутствие бактерий    │

│          │- Для введения в           │  семейства              │

│          │  дыхательные пути (за     │  Enterobacteriaceae в 1 │

│          │  исключением тех          │  г или в 1 мл           │

│          │  лекарственных средств,   │- Отсутствие Pseudomonas │

│          │  которые должны           │  aeruginosa в 1 г или в │

│          │  быть стерильными)        │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие             │

│          │                           │  Staphylococcus aureus в│

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 3.       │Для приема внутрь или      │- Общее число аэробных   │

│          │введения ректально         │                      3  │

│          │А. Лекарственные средства  │  бактерий не более 10  в│

│          │из субстанций              │  1 г или в 1 мл         │

│          │синтетического             │- Общее число грибов - не│

│          │происхождения              │          2              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в 1│

│          │                           │  мл                     │

│          │                           │- Отсутствие Escherichia │

│          │                           │  coli в 1 г или в 1 мл  │

│          ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│          │Б. Лекарственные средства  │- Общее число аэробных   │

│          │из субстанций природного   │                      4  │

│          │происхождения              │  бактерий не более 10  в│

│          │(растительного, животного  │  1 г или в 1 мл         │

│          │или минерального), за      │- Общее, число грибов -  │

│          │исключением лекарственных  │             2           │

│          │средств, включенных в      │  не более 10   в 1 г или│

│          │Категорию 4                │  в 1 мл                 │

│          │                           │- Отсутствие Escherichia │

│          │                           │  coli в 1 г или в 1 мл  │

│          │                           │- Отсутствие Salmonella в│

│          │                           │  10 г или в 10 мл       │

│          │                           │- Отсутствие Pseudomonas │

│          │                           │  aeruginosa в 1 г или в │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие             │

│          │                           │  Staphylococcus aureus в│

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Энтеробактерий - не    │

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10   в 1 г или в │

│          │                           │  1 мл                   │

│          ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│          │В. Детские лекарственные   │- Общее число аэробных   │

│          │средства                   │  бактерий не более 500 в│

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Общее число грибов - не│

│          │                           │  более 50 в 1 г или в 1 │

│          │                           │  мл                     │

│          │                           │- Отсутствие бактерий    │

│          │                           │  семейства              │

│          │                           │  Enterobacteriaceae в 1 │

│          │                           │  г или в 1 мл           │

│          │                           │- Отсутствие Pseudomonas │

│          │                           │  aeruginosa в 1 г или в │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие             │

│          │                           │  Staphylococcus aureus в│

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 4.       │Лекарственные средства,    │                         │

│          │состоящие из одного вида   │                         │

│          │сырья (фасованная          │                         │

│          │продукция) или нескольких  │                         │

│          │(сборы), а также           │                         │

│          │растительное сырье         │                         │

│          │"ангро"                    │                         │

│          │А. Лекарственные           │- Общее число аэробных   │

│          │растительные средства или  │                       7 │

│          │лекарственное сырье        │  бактерий не более 10   │

│          │"ангро", применяемые в     │  в 1 г или в 1 мл       │

│          │виде настоев и отваров,    │- Общее число грибов - не│

│          │приготовленные с           │           5             │

│          │использованием             │  более 10   в 1 г или в │

│          │термической обработки      │  1 мл                   │

│          │                           │- Escherichia coli - не  │

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10   в 1 г или в │

│          │                           │  1 мл                   │

│          ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│          │Б. Лекарственные           │- Общее число аэробных   │

│          │растительные средства      │                      5  │

│          │или растительное сырье     │  бактерий не более 10   │

│          │"ангро", применяемые без   │  в 1 г или в 1 мл       │

│          │термической обработки      │- Общее число грибов - не│

│          │                           │          4              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в  │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие Escherichia │

│          │                           │  coli - в 1 г или в 1 мл│

│          │                           │- Отсутствие Salmonella в│

│          │                           │  10 г или в 10 мл       │

│          │                           │- Энтеробактерий - не    │

│          │                           │          3              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в  │

│          │                           │  1 мл                   │

└──────────┴───────────────────────────┴─────────────────────────┘

 

Таблица 2

 

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА

СУБСТАНЦИЙ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

 

┌──────────┬───────────────────────────┬─────────────────────────┐

│ Категория│         Применение        │ Рекомендуемые нормы для │

│          │                           │Госфармакопеи XII издания│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│    1     │             2             │            3            │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│1.2.      │Субстанции для             │                         │

│          │производства:              │                         │

│          │- Стерильных               │- Общее число аэробных   │

│          │  лекарственных, средств   │  бактерий и грибов      │

│          │                           │  (суммарно)             │

│          │- Нестерильных             │             2           │

│          │  лекарственных средств,   │  не более 10  в 1 г или │

│          │  относящихся к Категории 2│  в 1 мл                 │

│          │                           │- Отсутствие бактерий    │

│          │                           │  семейства              │

│          │                           │  Enterobacteriaceae в   │

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │                         │

│          │- Нестерильных             │- Отсутствие Pseudomonas │

│          │  лекарственных средств,   │  aeruginosa в 1 г или в │

│          │  относящихся к Категории  │  1 мл                   │

│          │  3 В                      │- Отсутствие             │

│          │                           │  Staphylococcus         │

│          │                           │  aureus в 1 г или в 1 мл│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│2.2.      │Субстанции синтетического  │- Общее число аэробных   │

│          │происхождения для          │                      3  │

│          │производства нестерильных  │  бактерий не более 10  в│

│          │лекарственных средств      │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Общее число грибов - не│

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в 1│

│          │                           │  мл                     │

│          │                           │- Отсутствие Escherichia │

│          │                           │  coli - в 1 г или в 1 мл│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│3.2.      │Субстанции природного      │- Общее число аэробных   │

│          │происхождения              │                      4  │

│          │(растительного, животного  │  бактерий не более 10  в│

│          │или минерального)          │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Общее число грибов - не│

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в  │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие Escherichia │

│          │                           │  coli - в 1 г или в 1 мл│

│          │                           │- Отсутствие Salmonella в│

│          │                           │  10 г или в 10 мл       │

│          │                           │- Отсутствие Pseudomonas │

│          │                           │  aeruginosa в 1 г или в │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие             │

│          │                           │   Staphylococcus aureus │

│          │                           │   в 1 г или в 1 мл      │

│          │                           │- Энтеробактерий - не    │

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в  │

│          │                           │  1 мл                   │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│4.2.      │Вспомогательные материалы  │- Общее число аэробных   │

│          │(мука пшеничная, крахмал,  │                      3  │

│          │тальк и т.д.)              │  бактерий не более 10 в │

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Общее число грибов - не│

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в  │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие             │

│          │                           │  Escherichia coli - в   │

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Отсутствие Salmonella в│

│          │                           │  10 г или в 10 мл       │

│          │                           │- Отсутствие Pseudomonas │

│          │                           │  aeruginosa в 1 г или в │

│          │                           │  1 мл                   │

│          │                           │- Отсутствие             │

│          │                           │  Staphylococcus aureus в│

│          │                           │  1 г или в 1 мл         │

│          │                           │- Энтеробактерий - не    │

│          │                           │          2              │

│          │                           │  более 10  в 1 г или в  │

│          │                           │  1 мл                   │

└──────────┴───────────────────────────┴─────────────────────────┘

 

Примечания к таблицам 1 и 2:

- В фармакопейных статьях предприятия (ФСП) могут быть указаны в виде исключения и другие нормативы

- При обнаружении других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательного материала не соответствует требованиям по показателю "Микробиологическая чистота"

 

РАЗДЕЛ 2

ИСПЫТАНИЕ НА Enterobacteriaceae

 

Дополнение к разделу: "Выявление и идентификация семейства Enterobacteriaceae" общей ФС "Испытание на микробиологическую чистоту" ГФXI издания, выпуск 2, стр. 197-198.

 

    2.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

         ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ Escherichia coli и Salmonella

 

10 г или 10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды N 11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32.5 +/- 2.5 град. C в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. В случае, если лекарственное средство - суппозитории или растворы в маслах, в среду N 11 добавляют стерильный Твин-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы для эмульгирования.

Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, используя для этого среду N 3. В три пробирки с 10 мл среды N 3 вносят 1 мл гомогената в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и 1 мл разведения 1:100 в третью, то есть соответственно 0.1 г, 0.01 г, 0.001 г образца. Посевы инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на плотную среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по Таблице 3.

 

Таблица 3

 

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

 

Количество испытуемого образца     

Вероятное количество
бактерий в 1 г (мл) 

0.1 г (мл)

0.01 г (мл) 

0.001 г (мл) 

 

1 мл  
гомогената

1 мл гомогената
в разведении
1:10     

1 мл гомогената
в разведении 
1:100     

 

+    

+      

+       

Более 1000     

+    

+      

-       

От 100 до 1000 

+    

-      

-       

От 10 до 100   

-    

-      

-       

Менее 10       

 

    Обозначения: + - наличие роста бактерий

                 - - отсутствие роста бактерий

 

Количество клеток E.coli в 1 г (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также данной таблицей.

 

2.2. ИСПЫТАНИЕ НА НАЛИЧИЕ Escherichia coli и Salmonella

 

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл питательной среды N 11 (лактозный бульон). В случае, если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубируют при температуре (32.5+2.5) град. С в течение 2-5 ч. 10 мл среды N 11 переносят в 100 мл среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде N 3 (среда прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испытания продолжают.

 

2.2.1. ИСПЫТАНИЕ НА E.coli

 

Со среды N 3 делают пересев петлей на среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. C в течение 18-24 ч. На среде N 4 E.coli образуют, как правило, характерные малиновые колонии с металлическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду N 1 и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч. Из пробирок с чистой культурой делают пересевы на среды N 14 (агар Симмонса) и N 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на цитохромоксидазу. Через 18-24 ч инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах N 14 и N 15. Утилизацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды N 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды N 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

 

2.2.2. ИСПЫТАНИЕ НА ВИДЫ Salmonella

 

1 мл обогащенной культуры на среде N 3 вносят в пробирку с 10 мл среды N 12 (селенитовая среда) и инкубируют при (32,5 +/- 2,5) град. С в течение 16-18 ч. Делают пересев петлей на среду N 5 (висмут - сульфит агар) и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 24-48 часов. На среде N 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на среду N 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру со среды N 1. Через 18-24 часа инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают изменение цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода - типичном признаке видов Salmonella.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

 

2.3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ <*> И РЕАКТИВЫ

 

    1. Среда N 11   (лактозный  бульон)  -  для  предварительного

обогащения энтеробактерий

    Состав:

    Пептон ферментативный сухой            - 8 г

    Лактоза                                - 5 г

    Вода дистиллированная                  - 1000 мл

    ______________________________________________________________

    рН после стерилизации    6,9 +/- 0,1

 

2. Среда N 12 (селенитовая среда сухая) - для накопления и выделения сальмонелл.

 

Готовят согласно прописи на этикетке.

 

    3. Среда  N  13  (трехсахарный  агар  с  солями  железа) - для

выявления сероводорода

    Состав:

    Мясной экстракт                        - 3 г

    Дрожжевой экстракт                     - 3 г

    Пептон                                 - 20 г

    Лактоза                                - 10 г

    Сахароза                               - 10 г

    Глюкоза                                - 1 г

    Железа сульфат                         - 0,2 г

    Натрия хлорид                          - 5 г

    Натрия тиосульфат                      - 0,3 г

    Феноловый красный                      - 0,024 г

    Агар                                   - 15 г

    Вода дистиллированная                  - 1000 мл

______________________________________________________________

Рн после стерилизации 7.3 +/- 0.2. Разливают в пробирки по 5-7 мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см.

 

    4. Среда N 14 (цитратный агар Симмонса)

    Состав:

    Натрия хлорид                          - 5 г

    Магния сульфат                         - 0,2 г

    Аммония дигидрофосфат                  - 1 г

    Калия гидрофосфат                      - 1 г

    Натрия цитрат                          - 3 г

    Бромтимоловый синий                    - 0,08 г

    Агар                                   - 20 г

    Вода дистиллированная                  - 1000 мл

    ______________________________________________________________

    рН после стерилизации   7,2 +/- 0.1

 

Приготовление: агар расплавляют при нагревании в свежеприготовленной дистиллированной воде. Все соли сначала растворяют в небольшом объеме воды, затем раствор добавляют к расплавленному агару и доводят водой до 1000 мл. Устанавливают рН, добавляют индикатор в виде 0,2% водного раствора в объеме 40 мл, хорошо перемешивают и разливают в пробирки по 5-7 мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см.

 

5. Среда N 15 (бульон Хоттингера) - для определения индола.

 

Примечание: <*> - для испытания на микробиологическую чистоту можно использовать аналогичные сухие питательные среды отечественных и зарубежных производителей после их валидации.

 

Тест на индол

 

В пробирку со средой N 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача или Эрлиха и слегка встряхивают. При наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке.

 

    Реактив Ковача:

    Спирт амиловый или изоамиловый     - 75 мл

    Пара - диметиламинобензальдегид    - 5 г

    Кислота хлористоводородная, конц.  - 20 мл

Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (в водяной бане при 50-55 град. С), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте. Реактив должен быть желтого цвета.

 

    Реактив Эрлиха:

    Спирт этиловый 96%                 - 95 мл

    Пара - диметиламинобензальдегид    - 1 г

    Кислота хлористоводородная, конц.  - 20 мл

 

Навеску альдегида растворяют в спирте и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте.

 

РАЗДЕЛ 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

 

Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, могут подавлять рост отдельных видов бактерий и грибов. Если исследуемое лекарственное средство оказывает ингибирующее действие на микроорганизмы, которые выявляют в нестерильных лекарственных средствах, необходимо адекватно инактивировать его во избежание неправильной оценки результатов испытания на микробиологическую чистоту. Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств проводят с использованием тест - микроорганизмов, полученных из Государственных коллекций.

 

    3.1. ПОДГОТОВКА ТЕСТ - ШТАММОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

    АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

    СРЕДСТВ

 

    1. Тест - микроорганизмы

                                         1            2

    Bacillus cereus                  ATCC  10702 (NCTC  8035)

    Escherichia coli                 ATCC 25922

                                         4

    Pseudomonas aeruginosa           ГИСК  453

                                                    3

    Staphylococcus aureus            ATCC 6538-P(FDA  209-P)

    Candida albicans                 ATCC 885-653

                                        5

    Aspergillus niger                BKM  F-1119

    ______________________________________________________________

        1

    ATCC  - Американская коллекция типовых культур

        2

    NCTC  - Национальная коллекция типовых культур, Великобритания

       3

    FDA -  Управление  по  контролю  качества  пищевых продуктов и

лекарственных средств, США

        4

    ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий (ГИСК им.  Л.А.

Тарасевича), Россия

       5

    BKM  - Всероссийская коллекция микроорганизмов РАН, Россия

 

Тест - штаммы В. cereus, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus получают из Государственной Коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Штамм C.albicans получают из Российского Микологического Центра (г. Санкт - Петербург), штамм A.niger - из ВКМ - Всероссийской Коллекции микроорганизмов РАН (г. Москва). Культуры тест - микроорганизмов могут быть получены также из ВКПМ - Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов. Используемые тест - штаммы должны быть типичными по культурально - морфологическим и биохимическим свойствам.

 

    Тест -  штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град.

С  в  лиофилизированном  состоянии  или  под   слоем   стерильного

вазелинового масла на среде Романова следующего состава:

    Панкреатический гидролизат казеина     8.0 г

    Натрия хлорид                          5.0 г

    Агар                                  10.0 г

    Вода дистиллированная               1000.0 г

    ______________________________________________________________

    рН после стерилизации 7.1 +/- 0.1

 

Тест - культуру C.albicans хранят под слоем вазелинового масла на среде N 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 1%. Тест - культуру A.niger хранят на среде N 2 (агар Сабуро) (Госфармакопея, вып. 2, с. 200), делая пересевы через каждые 3 месяца. Лиофилизированную культуру тест - штамма из ампулы или культуру со среды хранения переносят в пробирки с питательным бульоном: среда N 8 для бактерий, жидкая среда Сабуро - для C.albicans. Посевы на среде N 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течении 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро - при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч - для C.albicans. Посевы A.niger на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С до появления черных или темно - коричневых экзогенных спор (конидий) в течении 5-7 сут.

Перед определением антимикробного действия нестерильных лекарственных средств культуры тест - штаммов бактерий отсевают на среду N 8 (питательный бульон) и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч.

Культуры грибов выращивают заранее: C.albicans - на жидкой среде Сабуро за 48 ч, а A.niger - на среде N 2 за 5-7 сут до начала определения.

 

    3.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РАСТВОРЫ

    (Государственная фармакопея XI издания,

    выпуск 2, с. 193, 201, 208-209)

 

    Среда N 8 -               для выращивания бактерий.

    Жидкая среда Сабуро -     для выращивания Candida albicans.

    Среда N 2 (агар Сабуро) - для выращивания Aspergillus niger.

    Среды NN 3-5 -            для идентификации бактерий

                              семейства Enterobacteriaceae.

    Среда N 9 -               для идентификации Pseudomonas

                              aeruginosa.

    Среда N 10 -              для идентификации Staphylococcus

                              aureus.

Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном, рН 7.0

 

3.3. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

 

Готовят разведения лекарственного средства 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, используя фосфатный буферный раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5% Твина-80).

Бульонные культуры бактерий и C.albicans разводят фосфатным буферным раствором не менее, чем 1:1000. Культуру A.niger смывают со скошенного агара фосфатным буферным раствором с 0.05% Твина-80. Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру

Горяева  или  чашечный  агаровый метод, и разводят до концентрации

  3     4

10 -  10  КОЕ/мл.

Испытание проводят представленными в 3.3.1. и 3.3.2. методами определения антимикробного действия.

 

3.3.1. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ГОСФАРМАКОПЕИ XI

 

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0.2 мл взвеси культуры B.cereus, a в оставшиеся - по 0.2 мл культуры C.albicans и A.niger. В чашки с B.cereus вносят по 7-10 мл расплавленной среды N 1 при температуре (47.5 +/- 2.5) град. С, в чашки с культурами C.albicans и A.niger - то же количество среды N 2.

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - N 3 и N 8. В пробирки со средой N 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры E.coli, в пробирки со средой N 8 - по 1 мл взвеси культур P.aeruginosa и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений лекарственного средства вносят такое же количество буферного раствора.

Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 2 сут (среды N 3, 8) и 5 сут (среда N 1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/-2.5) град. C в течение 5 сут. В случае, если при внесении лекарственного средства в жидкие питательные среды (N 3, N 8) образуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды N 3 на среду N 4 (агар Эндо), а со среды N 8 - на среды N 9 и N 10. При росте типичных колоний E.coli (среда N 4), P.aeruginosa (среда N 9) и S.aureus (среда N 10) отмечают наличие роста тест - микроорганизма.

 

3.3.2. МЕТОД РЕПЛИКАЦИЙ (для водонерастворимых лекарственных средств). В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого лекарственного средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для получения разведения. В чашки Петри (как в эксперименте, так и в контроле) добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до (47.5 +/- 2,5) град. С среды N 1, в другие - такое же количество среды N 2 и быстро перемешивают. После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды.

На поверхность агара бактериологической петлей или репликатором наносят бляшками инокулят каждого тест - штамма бактерий и грибов на среды N 1 и N 2 соответственно.

Чашки со средой N 1 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч. Чашки со средой N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение - 3-5 сут.

Учет результатов. После окончания сроков инкубации посевов (появление типичного роста тест - микроорганизмов в контрольных чашках без лекарственного средства) отмечают наличие или отсутствие роста тест - штаммов бактерий и грибов на средах, в которые вносили различные разведения лекарственного средства.

Наличие такого же роста тест - микроорганизма, как в контроле, обозначают знаком "+", отсутствие роста - знаком "-", слабый или замедленный рост - знаком "+/-".

Отсутствие роста тест - микроорганизма на среде с препаратом свидетельствует о том, что исследуемый препарат в данном разведении обладает антимикробным действием в отношении определенного тест - микроорганизма.

 

3.3.3. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

 

Для устранения антимикробного действия лекарственного средства используют различные методы: - 1) увеличивают разведение лекарственного средства, 2) добавляют необходимое количество соответствующего специфического инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов - контаминантов (например, бета - лактамазу - для пенициллинов и цефалоспоринов, пара - аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов), 3) применяют неспецифический инактиватор следующего состава, используемого в качестве растворителя:

 

    Твин-80                               - 30 г

    Лецитин яичный                        - 3 г

    L-гистидина гидрохлорид               - 1 г

    Пептон (мясной или казеиновый)        - 1 г

    Натрия хлорид                         - 4.3 г

    Калия фосфат однозамещенный           - 3.6 г

    Натрия фосфат двузамещенный           - 7.2 г

    Воды дистиллированной                 - 1000.0 мл

 

Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Если антимикробное действие полностью не устраняется, увеличивают концентрацию Твина-80 или лецитина.

 

Директор ИГКЛС НЦЭГКЛС

Минздрава России

профессор, академик МАИ

Н.С.ЕВТУШЕНКО

10 апреля 2001 г.

 

Председатель Государственного

Фармакопейного комитета,

профессор, чл.- корр. РАМН

А.П.АРЗАМАСЦЕВ

4 июля 2001 г.

 

Главный Ученый секретарь

Государственного Фармакопейного

комитета, доктор фарм. наук

В.Л.БАГИРОВА

4 июля 2001 г.