"Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

Условное обозначение: "+" - рекомендуемая среда.

Общим правилом является использование при посеве материала, содержащего смешанную микрофлору (испражнения, гной и т.п.), пластинчатых сред высоко селективного действия (Плоскирева, ВСА, с добавлением антибиотиков и др.). Материал, обычно стерильный (кровь, спинномозговая жидкость и т.п.), сеют на слабо селективные дифференциальные среды (ЭМС, Эндо) или СПА.

С целью накопления сальмонелл при исследовании испражнений или другого материала, содержащего обильную сопутствующую флору, могут быть использованы такие среды, как магниевая, селенитовая, Кауфмана или Мюллера, а при исследовании крови, спинномозговой жидкости и соскоба с розеол - желчный бульон, среда Рапопорт или (для крови) дистиллированная и водопроводная вода. Для накопления иерсиний при исследовании всех материалов применяют буферную среду или ИХН, а для клебокелл и энтеробактеров при исследовании крови - глюкозный бульон.

Прямой посев исследуемой пробы материала на пластинчатые селективно-дифференциальные среды и посев (при необходимости) в пробирку с жидкой средой обогащения проводят одновременно. При посеве на плотные среды исследуемый материал наносят с помощью бактериологической петли, стеклянной палочки, ректального тампона или пипетки с последующим втиранием материала шпателем или петлей по всей поверхности среды. На высоко селективные среды посевной материал вносят в большем объеме (в 3 - 5 раз), чем на слабо селективные. В средах с антибиотиками, приготовленных "методом градиентной чашки" или с использованием бумажных полосок, посевной материал вносят в зону среды с антибиотиком и распределяют его далее, как описано. Посев в среды для "метода подвижного роста" проводят в соответствии с "Методическими рекомендациями по выделению сальмонелл из испражнений методом "подвижного роста" (МЗ СССР, 1978).

Все указанные посевы (кроме целенаправленных посевов для выделения иерсиний) инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 часов (до 48 часов на ВСА). Инкубация засеянной селенитовой среды не должна превышать 18 часов. По окончании инкубации из сред обогащения для сальмонелл делают высевы на ВСА (при исследовании материала, содержащего сопутствующую микрофлору), а при исследовании крови, спинномозговой жидкости и соскоба с розеол - на среды Эндо (ЭМС), СПА, на последние делают высев также из сред обогащения для иерсиний и клебокелл (энтеробактеров), соблюдая правила посева и инкубации, как при прямом посеве.

При целенаправленном исследовании для выделения иерсиний лучше использовать среду Эндо, чем ЭМС. Посевы на этих средах инкубируют при 22° - 25 °C в течение 18 - 48 часов, просматривая чашки повторно через 48 часов инкубации. Засеянную буферную среду или ИХН сохраняют в холодильнике (4° - 6 °C), первый высев на пластинчатую среду проводят через 24 - 36 часов инкубации, а при отрицательных результатах высевы повторяют на 5, 7, 11 и 14 дни инкубации.

Помимо указанных общих правил, требуется соблюдение особенностей посева с учетом характера исследуемого материала.

Испражнения, если они доставлены без консерванта, суспендируют в ИХН в соотношении 1:5 или 1:10, после чего используют для посева на пластинчатые среды. Неразведенные испражнения вносят в среду обогащения в соотношении 1:5 и тщательно перемешивают. При взятии материала ректальным тампоном его погружают в среду обогащения после посева на пластинчатые среды.

При посеве в селенитовую среду обогащения испражнений, доставленных в лабораторию в фосфатно-буферном консерванте (но не в глицериновом), возможно применение среды двойной концентрации с соблюдением соотношения посевного материала и среды 1:1.

Кровь. Через 18 - 20 часов после посева, выполненного, как указано в предыдущем разделе, и инкубации при 37 °C делают высев на одну из слабо селективных пластинчатых сред или на СПА, при отрицательных результатах высевы повторяют на 3, 4, 6 и 10 сутки.

Рвотные массы и промывные воды желудка, не подвергавшиеся центрифугированию, засевают с целью обогащения в соответствующие накопительные среды двойной концентрации, соблюдая соотношения засеваемого материала и среды 1:1, при посеве центрифугата применяют среды обогащения обычной концентрации.

Желчь (дуоденальное содержимое) засевают во флаконы с 50 мл СПБ в соотношении 1:10 и на пластинчатые среды (Эндо, ЭМС). Оставшуюся желчь также помещают в термостат, делая из нее высев через 18 - 20 часов и на 3, 5, 7 сутки (в случае отрицательных результатов предыдущих высевов) на пластинчатые среды подобно высевам со сред обогащения.

Мочу после центрифугирования (или без него) сеют на пластинчатые среды (ЭМС, Эндо), а также в среды обогащения, нецентрифугированную мочу - в среды двойной концентрации в соотношении 1:1.

Гной, пунктаты органов, экссудат, слизь из зева и носа, мокроту, отделимое цервикального канала <*>, женское грудное молоко <*> засевают в жидкие среды обогащения и на плотные питательные среды (табл. 3).

--------------------------------

<*> Женское грудное молоко исследуют при наличии специальных показаний.

Спинномозговую жидкость засевают в жидкие питательные среды для обогащения и на пластинчатые среды (табл. 3).

Соскоб с розеол, полученный, как указано в предыдущем разделе, засевают в среду обогащения с последующим высевом на пластинчатые среды.

Операционный материал - содержимое червеобразного отростка, желчного и мочевого пузыря исследуют как испражнения, желчь и мочу соответственно, а биоптаты органов или тканей засевают аналогично секционному материалу.

Секционный материал засевают, как указано в разделе "Материал для исследования" либо непосредственно на пластинчатые среды путем прикосновения (отпечатка) поверхности среза кусочков органов к агару, либо после получения взвеси засевают на плотные среды и, если это необходимо, в среды обогащения. Кровь, мочу, желчь исследуют, как указано для этих материалов.

После культивирования посевов, просмотра чашек и отбора выросших колоний для дальнейшего исследования руководствуются их характеристиками, приведенными в соответствии с родовой принадлежностью энтеробактерий (табл. 4). Следует помнить, что колонии, подозрительные на принадлежность к шигеллам или сальмонеллам, подлежат первоочередному отсеву и изучению (не менее 3 колоний). При их отсутствии и показаний к исследованию с целью выделения других представителей энтеробактерий снимают для изучения по 2 - 3 колонии с различными морфологическими характеристиками.

Таблица 4

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ РАЗЛИЧНЫХ РОДОВ

┌────────────┬────────────────┬────────────────┬───────────────┬────────────────────────┐

│ \ Среда │ Плоскирева │ Эндо │ ЭМС │ Другие среды │

│ Род \ │ │ │ │ │

├────────────┼────────────────┴────────────────┴───────────────┼────────────────────────┤

│Shigella │Небольшие (1 - 1,5 мм в диаметре), бесцветные, │На СПА S. sonnei нередко│

│ │слегка выпуклые, с ровным краем и блестящей │образуют колонии I и II │

│ │поверхностью, прозрачные. S. dysenteriae 1 │фаз │

│ │формируют более мелкие и нежные колонии, а на │ │

│ │среде Плоскирева растут скудно │ │

│ │ │S. sonnei образуют иногда, кроме│ │

│ │ │описанных (I фаза), и колонии │ │

│ │ │более крупные, плоские, с │ │

│ │ │неровным краем, напоминающие │ │

│ │ │виноградный лист (II фаза) │ │

├────────────┼────────────────┴────────────────────────────────┴────────────────────────┤

│Salmonella │Размер чаще 2 - 2,5 мм в диаметре, иногда и 1 мм, слегка выпуклые, с │

│ │ровным краем и гладкой поверхностью, влажные │

│ │Бесцветные, │обычно │обычно │на СПА колонии голубова-│

│ │мутноватые, │прозрачные, │прозрачные, с │тые, мелкие, прозрачные;│

│ │уплотненные │слегка розоватые│небольшим │на ВСА - черные, с ха- │

│ │ │ │фиолетовым │рактерным металлическим │

│ │ │ │оттенком │блеском, среда под коло-│

│ │ │ │ │ниями прокрашена в чер- │

│ │ │ │ │ный цвет, колонии │

│ │ │ │ │S. paratyphi A зеленова-│

│ │ │ │ │тые, светлые, нежные │

├────────────┼────────────────┼────────────────┼───────────────┼────────────────────────┤

│Escherichia │Рост значительно│ │ │ │

│ │подавляется │ │ │ │

│ │Более крупные, чем колонии шигелл и сальмонелл, │ │

│ │многообразие по окраске, плотности и форме; могут│ │

│ │быть выпуклые или плоские, с ровным или слегка │ │

│ │волнистым краем, непрозрачные или полупрозрачные │ │

│ │и слегка опалесцирующие, влажные или сухие, иног-│ │

│ │да слизистые, напоминающие колонии клебсиелл, а │ │

│ │также более нежные и прозрачные, похожие на коло-│ │

│ │нии шигелл и сальмонелл; у лактозоположительных │ │

│ │штаммов на среде Эндо - темно-красные с металли- │ │

│ │ческим блеском или без него, розовые или с бес- │ │

│ │цветным ободком и интенсивно красным или розовым │ │

│ │центром, а на среде ЭМС - темно-синие с металли- │ │

│ │ческим блеском или розовые; у лактозоотрицатель- │ │

│ │ных штаммов - под цвет среды или с розоватым │ │

│ │оттенком (на Эндо и ЭМС), а на среде Плоскирева -│ │

│ │с желтоватым оттенком │ │

├────────────┼─────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Citrobacter │Более крупные, чем колонии шигелл и сальмонелл, │На ВСА колонии светло- │

│ │выпуклые; у лактозоотрицательных штаммов - слегка│зеленые, коричневые или │

│ │опалесцирующие, в тон среды или с розоватым │черные │

│ │оттенком; у лактозоположительных - интенсивно │ │

│ │розовые или красные с темным центром, но не │ │

│ │дающие характерного для эшерихий металлического │ │

│ │блеска; рост колоний сопровождается резким │ │

│ │неприятным запахом │ │

│Klebsiella │Большие (диаметр 3 мм), выпуклые, влажные, │ │

│ │слизистые, нередко сливающиеся друг с другом или │ │

│ │менее крупные, неслизистые, сухие; колонии лакто-│ │

│ │зоположительных штаммов сходны с колониями эшери-│ │

│ │хий, с металлическим блеском или без него; коло- │ │

│ │нии могут быть красные, розовые, белые, прозрач- │ │

│ │ные, бесцветные, с белым ободком в сочетании с │ │

│ │темным или розоватым центром, а на среде │ │

│ │Плоскирева могут быть бежевые или желтые │ │

├────────────┼────────────────┬────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Yersinia │ │В течение первых суток роста │На СПА в первые сутки │

│ │ │(при 22 °C) колонии мелкие │(при 22 °C) колонии │

│ │ │(росинки), обычно выпуклые, │Y. enterocolitica │

│ │ │блестящие, бесцветные, с ровным │небольшие, блестящие, │

│ │ │краем; в течение вторых суток │прозрачные, голубоватые,│

│ │ │становятся крупнее, при этом │мягкой консистенции, у │

│ │ │колонии Y. enterocolitica (на │Y. pseudotuberculosis - │

│ │ │ЭМС) фиолетовые с металлическим │полупрозрачные, белова- │

│ │ │блеском, могут приобретать │то-желтые, при 37 °C │

│ │ │розовый оттенок, а │колонии более крупные, │

│ │ │Y. pseudotuberculosis остаются │менее прозрачные, с ис- │

│ │ │неокрашенными │черченной поверхностью, │

│ │ │ │волнистым или исчерчен- │

│ │ │ │ным краем, желтоватые │

├────────────┼────────────────┴────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Enterobacter│По размеру, форме и окраске сходные с колониями │ │

│ │эшерихий и клебсиелл │ │

│Hafnia │Полупрозрачные, бесцветные или имеющие оттенок │ │

│ │среды, розоватые, сероватые; на среде Плоскирева │ │

│ │дают скудный рост и нередко напоминают колонии │ │

│ │шигелл │ │

│Serratia │Бесцветные, по размеру и форме трудно отличимые │На СПА колонии многих │

│ │от колоний шигелл или сальмонелл │штаммов продуцируют пиг-│

│ │ │мент розового, красного │

│ │ │или фуксинового цвета │

│Proteus │2 - 3 мм в диа- │P. vulgaris, P. mirabilis, │На ВСА через 48 часов │

│ │метре, прозрач- │проявляя способность роения, │роста колонии влажные, │

│ │ные и полупроз- │дают сливной рост, другие виды │грязно-коричневого │

│ │рачные, слегка │образуют колонии, сходные с │цвета, после их снятия │

│ │выпуклые и с │колониями сальмонелл или шигелл,│на среде остается темно-│

│ │желтовато-розо- │колонии P. inconstans весьма │коричневая редукционная │

│ │вым (перламутро-│сходные с колониями шигелл │зона │

│ │вым) оттенком, │ │ │

│ │вокруг колоний │ │ │

│ │желтоватый ореол│ │ │

│Edwardsiella│Бесцветные или слегка розоватые (на Эндо), полу- │На ВСА колонии темные, │

│ │прозрачные, сходные с колониями сальмонелл или │без металлического │

│ │шигелл │блеска и почернения │

│ │ │среды под ними; на среде│

│ │ │Эт-2 - малинового цвета │

│ │ │с черным центром │

│Erwinia │При 37 °C не растут или дают замедленный скудный │ │

│ │рост; при 25 - 27 °C (оптимальной температуре │ │

│ │культивирования) колонии с разнообразными харак- │ │

│ │теристиками, более всего сходные с колониями │ │

│ │эшерихий │ │

└────────────┴─────────────────────────────────────────────────┴────────────────────────┘

Для получения количественных показателей обсеменения исследуемого материала УПЭ в случаях их выявления в отсутствие патогенных энтеробактерий и решения вопроса об этиологической значимости могут быть проведены дозированные посевы из проб материала на пластинчатые среды.

Для жидких субстратов (клинический материал) разведения готовят

объемным методом, разводя 0,1 - 1,0 мл исследуемой пробы в соотношении 1:10

-1

(разведение 10 ) в ИХН. Далее в двух пробирках, содержащих по 9,9 мл того

-3 -5

же раствора, последовательно готовят разведения 10 и 10 , перенося по

0,1 субстрата из предыдущего разведения. Всю работу проводят с соблюдением

правил асептики, со сменой градуированных пипеток при переходе от

предыдущего разведения к последующему. При исследовании испражнений

предварительно следует приготовить навеску в пределах от нескольких

дециграмм до одного грамма, разведения готовят, как указано ранее. Для

количественного учета УПЭ на пластинчатые дифференциально-селективные среды

-3 -5

высевают по 0,1 мл из разведений 10 и 10 и тщательно растирают

нанесенный на поверхность среды материал. На последующих этапах при

подсчете выросших колоний их число умножают на соответствующее разведение

(из которого проводили высев на чашку) и на 10, т.к. была высеяна доза 0,1

-3

мл. Например: высев из разведения 10 привел к развитию в чашке 30

колоний, однородных по своим характеристикам и отнесенных к роду

Citrobacter. Для определения содержания их в 1 грамме исследованного

материала 30 умножают на 1000 и на 10 (30 х 1000 х 10 = 300000 = 3 х 10 ).

Таким образом устанавливают, что в 1 грамме материала содержалось 3 х 10

бактерий рода Citrobacter.

Отобранные для дальнейшего изучения колонии пересевают в одну из сред для первичной идентификации. При целенаправленном исследовании на ЭПЭ первичный отбор колоний (не менее 2 - 3 каждой разновидности) проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки OKA (к большому числу наиболее распространенных сероваров ЭПЭ). Остаток колонии, давшей агглютинацию с указанной сывороткой, отсевают в среду для первичной идентификации и на скошенный агар (для дальнейшего серологического изучения).

2.3. Идентификация энтеробактерий

Идентификация энтеробактерий включает три этапа: а) первичную идентификацию; б) установление рода (дифференциацию родов) и в) идентификацию вида и внутривидовую дифференциацию.

Выполнение первого типа предусматривает определение биохимических признаков изучаемой культуры с использованием сред для первичной идентификации (комбинированных сред), а при необходимости и тестов для дифференциации энтеробактерий от других грамотрицательных бактерий. На втором этапе применяют тесты минимального дифференцирующего ряда в наборе, необходимом для установления рода (дифференциации от сходных родов), а также вида у тех родов энтеробактерий, которые представлены единственным видом. Третий этап идентификации предполагает использование дополнительных биохимических тестов для внутривидовой дифференциации - определение видов, внутривидовую дифференциацию, а при необходимости и наличии соответствующих коммерческих диагностических сывороток и серологическую внутривидовую дифференциацию.

При выделении шигелл, сальмонелл и ЭПЭ три этапа идентификации, а при исследовании с целью выделения других энтеробактерий - первые два этапа идентификации и частично третий этап (до вида) осуществляют все бактериологические лаборатории. Внутривидовую дифференциацию энтеробактерий, не относящихся к шигеллам, сальмонеллам и ЭПЭ, проводят в соответствующих лабораториях (см. "Общее примечание").

2.3.1. Первичная идентификация

Для этой цели применяют, как указывалось, комбинированные среды - Олькеницкого или Клиглера, на которых наряду с получением культуры для дальнейшего изучения выявляют одновременно несколько ее признаков: способность образовывать сероводород и отношение к глюкозе, лактозе (а также сахарозе и мочевине - на среде Олькеницкого). Посев материала из колонии на комбинированную среду проводят бактериологической петлей вначале по скошенной части штрихом и заканчивают уколом в толщу агарового столбика, не достигая дна пробирки. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 часов, а при целенаправленных исследованиях на иерсинии - в течение того же времени, но при 22° - 25 °C.

О ферментации лактозы (и сахарозы) в среде Олькеницкого и ферментации

лактозы в среде Клиглера судят по появлению желтой окраски в скошенной

части агара, а о ферментации глюкозы - по такому же окрашиванию в столбике.

Газообразование устанавливают по появлению пузырьков, разрывам агара или

его отслоению от стенок пробирки. Образование сероводорода устанавливают по

почернению среды обычно в средней части столбика, при значительной

продукции H S можно наблюдать почернение всей среды. В среде Олькеницкого

при росте культуры, гидролизующей мочевину, происходит подщелачивание,

вследствие чего среда приобретает диффузный яркий красно-малиновый цвет. В

этом случае учет ферментации углеводов невозможен. При интенсивном

образовании сероводорода, когда чернеет целиком вся среда, учет ферментации

углеводов в средах Клиглера и Олькеницкого затруднен. Однако следует

помнить, что образование сероводорода может происходить лишь в кислой

среде, которая создается за счет ферментации глюкозы, присущей всем

энтеробактериям. Кроме того, при просмотре среды в проходящем свете в

столбике обычно видны на общем черном фоне участки пожелтевшего агара,

свидетельствующие о ферментации углеводов.

По совокупности биохимических свойств, выявленных на комбинированной среде, делают предположительное заключение о возможной родовой принадлежности культуры. Далее выбирают дифференциально-диагностические тесты, необходимые для установления рода энтеробактерий, т.е. проводят дифференциацию родов (табл. 5). Для эшерихий, эдвардсиелл, гафний и серраций это совпадает с определением вида.

Таблица 5

ПЕРВИЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

ПО БИОХИМИЧЕСКИМ РЕАКЦИЯМ В КОМБИНИРОВАННОЙ СРЕДЕ

И ВЫБОР ТЕСТОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ РОДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ <*>

--------------------------------

<*> Сведения по роду Erwinia не включены, так как при обычном (37 °C) культивировании посевов на пластинчатых средах указанные энтеробактерии не растут или дают замедленный скудный рост.

┌─────────────────────────────────┬──────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ Реакция в среде Олькеницкого, │ Предполагаемые │Тесты и субстраты для установления│

│ Клиглера │ энтеробактерии │ рода энтеробактерий │

├────────┬───────┬───────┬────────┤ │ │

│лактоза │глюкоза│серо- │мочевина│ │ │

│и (или) │ │водород│ <***> │ │ │

│сахароза│ │ │ │ │ │

│ <**> │ │ │ │ │ │

├────────┼───────┼───────┼────────┼──────────────────┼──────────────────────────────────┤

│- │к │- │- │Shigella, │Подвижность (при 37° и 22 °C), │

│ │ │ │ │некоторые серовары│индол, натрия ацетат, фенилаланин-│

│ │ │ │ │сальмонелл │дезаминаза, лизиндекарбоксилаза, │

│ │ │ │ │ │мочевина (по Преусу или Кристенсе-│

│ │ │ │ │ │ну), реакция Фогеса - Проскауэра и│

│ │ │ │ │ │проба с метиловым красным (при 22 │

│ │ │ │ │ │°C), пробы с поливалентными │

│ │ │ │ │ │сальмонеллезным и дизентерийным │

│ │ │ │ │ │фагами, серологические пробы с │

│ │ │ │ │ │поливалентными сыворотками к │

│ │ │ │ │ │сальмонеллам и шигеллам │

│- │кг │- │- │S. paratyphi A и │Подвижность (при 37° и 22 °C), │

│ │ │ │ │некоторые другие │индол, натрия ацетат, фенилаланин-│

│ │ │ │ │серовары сальмо- │дезаминаза, лизиндекарбоксилаза, │

│ │ │ │ │нелл, некоторые │реакция Фогеса - Проскауэра и │

│ │ │ │ │биовары │пробы с метиловым красным (при 22 │

│ │ │ │ │S. flexneri 6, │°C), пробы с поливалентными саль- │

│ │ │ │ │Escherichia, │монеллезным и дизентерийным фага- │

│ │ │ │ │Hafnia, │ми, серологические пробы с полива-│

│ │ │ │ │P. inconstans, │лентными сыворотками к сальмонел- │

│ │ │ │ │Serratia │лам и шигеллам │

│- │к │+ │- │S. typhi и некото-│Проба с поливалентным сальмонел- │

│ │ │ │ │рые другие серова-│лезным фагом и поливалентными │

│ │ │ │ │ры сальмонелл │сыворотками к сальмонеллам; см. │

│ │ │ │ │ │тесты для идентификации сероваров │

│- │кг │+ │- │Salmonella, │Индол, сорбит, лизиндекарбоксила- │

│ │ │ │ │Citrobacter, │за, пробы с поливалентным сальмо- │

│ │ │ │ │Edwardsiella │неллезным фагом и поливалентными │

│ │ │ │ │ │сыворотками к сальмонеллам │

│+ │к │- │- │Escherichia, │Цитрат Симонса, мочевина (по │

│ │ │ │ │Citrobacter или не│Преусу или Кристенсену), редукция │

│ │ │ │ │энтеробактерии │нитратов, цитохромоксидаза │

│+ │кг │- │- │Escherichia, │Цитрат Симонса, подвижность, ин- │

│ │ │ │ │Citrobacter, │дол, реакция Фогеса - Проскауэра, │

│ │ │ │ │Klebsiella, │проба с метиловым красным, лизин- │

│ │ │ │ │Enterobacter, │декарбоксилаза, орнитиндекарбокси-│

│ │ │ │ │Serratia │лаза, мочевина (по Преусу или │

│ │ │ │ │ │Кристенсену) │

│+ │кг │+ │- │Citrobacter │См. тесты для идентификации видов │

│. │. │. │+ │Proteus (кроме │Фенилаланиндезаминаза, см. тесты │

│ │ │ │ │P. inconstans), │для идентификации видов │

│ │ │ │ │Yersinia │ │

│. │г │. │+ │Proteus (кроме │См. тесты для идентификации видов │

│ │ │ │ │P. inconstans) │ │

│- │- │- │- │Не энтеробактерии │См. текст к табл. 6 │

│+ │- │- │- │Не энтеробактерии │См. текст к табл. 6 │

└────────┴───────┴───────┴────────┴──────────────────┴──────────────────────────────────┘

--------------------------------

<**> При использовании среды Олькеницкого.

<***> При использовании среды Клиглера проводят параллельный посев в среду с мочевиной (по Преусу или по Кристенсену).

Условные обозначения: "+" - положительная реакция, указывающая на ферментацию лактозы и (или) сахарозы, образование сероводорода, гидролиз мочевины; "-" - отрицательная реакция по тем же тестам; "к" - ферментация глюкозы без газообразования; "кг" - ферментация глюкозы с газообразованием; "." - учет реакции невозможен.

В связи с тем, что набор определяемых с помощью комбинированных сред биохимических признаков не является достаточным для установления рода энтеробактерий, серологическую идентификацию исследуемой культуры на данном этапе не проводят, кроме постановки серологических проб с поливалентными сыворотками к сальмонеллам и шигеллам, помогающих выбору биохимических тестов для дальнейшей идентификации. Исключение возможно при чрезвычайных эпидемических ситуациях, при этом к серологическому исследованию культуры приступают после проведения пересевов с этой среды на необходимые среды минимального дифференцирующего ряда, а полученные результаты серологической идентификации рассматривают как сугубо ориентировочные, требующие подтверждения на этапе завершенной биохимической идентификации.

При возникновении сомнений в принадлежности изучаемой культуры к семейству Enterobacteriaceae (см. табл. 5) следует использовать тесты, позволяющие дифференцировать энтеробактерии от других грамотрицательных микроорганизмов. В числе этих тестов: изучение морфологических (палочка, кокк) и тинкториальных свойств микроорганизмов путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму (+ или -); OF-тест, т.е. тип утилизации глюкозы - окисление (O), ферментация (F) или отсутствие активности (-); определение таких ферментов, как цитохромоксидаза, нитратредуктаза (редукция нитратов в нитриты), см. табл. 6.

Таблица 6

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ОТ НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

┌────────────────────┬──────────────────────────────┬───────┬─────────┬─────────┐

│ \ Дифференци- │ Морфология │OF-тест│Цитохром-│Нитрат- │

│ \рующие тесты│ │ │оксидаза │редуктаза│

│Микро- \ │ │ │ │ │

│организмы \ │ │ │ │ │

├────────────────────┼──────────────────────────────┼───────┼─────────┼─────────┤

│Enterobacteriaceae │Небольшие полиморфные палочки;│F │- │+ │

│ │подвижные (перитрихи) или │ │ │ │

│ │неподвижные; без капсулы или с│ │ │ │

│ │капсулами │ │ │ │

│Pseudomonas │Прямые или изогнутые одиночные│O │+ │X │

│ │палочки; подвижные (моно- или │ │ │ │

│ │лофотрихи); без капсул, часто │ │ │ │

│ │образующие пигмент синего, │ │ │ │

│ │зеленого, фиолетового или др. │ │ │ │

│ │цвета │ │ │ │

│Vibrio │Короткие изогнутые или прямые │F │+ │+ │

│ │палочки, одиночные или образу-│ │ │ │

│ │ющие S-образные нити, спирали;│ │ │ │

│ │подвижные (монотрихи), без │ │ │ │

│ │капсул │ │ │ │

│Aeromonas │Прямые палочки с закругленными│F │+ │+ │

│ │концами или кокковидные; рас- │ │ │ │

│ │полагаются поодиночке, парами,│ │ │ │

│ │цепочками; подвижные (монотри-│ │ │ │

│ │хи) или неподвижные │ │ │ │

│Plesiomonas │Прямые палочки, располагаются │F │+ │+ │

│ │поодиночке, парно или цепочка-│ │ │ │

│ │ми; подвижные (лофотрихи) │ │ │ │

│Flavobacterium │Тонкие палочки или кокковидные│O или │+ <**> │X │

│ │формы; подвижные (перитрихи) │-, F │ │ │

│ │или неподвижные <*> │ │ │ │

│Moraxella │Однородные или полиморфные, │- │+ │X │

│ │короткие толстые палочки, │ │ │ │

│ │часто кокковидные; неподвижные│ │ │ │

│Aloaligenes │Одиночные палочки, кокковые │- │+ │X │

│ │или кокковидные формы; │ │ │ │

│ │подвижные (перитрихи) │ │ │ │

│Acinetobacter │Короткие толстые палочки или │O или -│- │- <***> │

│ │кокковидные формы; парно или │ │ │ │

│ │цепочками; неподвижные; без │ │ │ │

│ │капсулы или с капсулами │ │ │ │

└────────────────────┴──────────────────────────────┴───────┴─────────┴─────────┘

--------------------------------

<*> При росте на твердых питательных средах образуют колонии желтого, оранжевого, красного или коричневого цвета; оттенок пигмента зависит от состава среды и температуры культивирования.

<**> Кроме F. meningosepticum, дающих отрицательную реакцию.

<***> За исключением единичных штаммов Acinetobacter calcoaceticum.

Обозначения: "+" - положительная реакция; "-" - отрицательная реакция; X - разные реакции; O - окисление; F - ферментация.

Микроскопию окрашенных по Граму мазков из сомнительных культур следует считать первоочередной, так как при этом могут быть выявлены особенности (например, кокковая форма), исключающие необходимость использования других тестов. Нечеткие результаты окраски по Граму (у некоторых штаммов микроорганизмов родов Acinetobacter, Moraxella и Bacillus) могут быть уточнены при использовании пробы с KOH. Для этого культуру суспендируют в капле 3-процентного раствора KOH на предметном стекле. При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, жидкость в капле становится вязкой, нити тянутся за петлей на 0,5 - 2 см. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.

Для постановки OF-теста изучаемую культуру засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона (одновременно в две пробирки), в одну из которых затем вносят стерильное вазелиновое масло (0,5 - 1 мл). Посевы делают небольшой петлей, не доводя ее до дна пробирки на 5 - 6 мм, инкубируют при 37 °C в течение 1 - 4 суток. Изменение цвета среды на желтый в обеих пробирках указывает на расщепление глюкозы путем ферментации (F), появление желтой окраски среды только в открытой пробирке, не залитой вазелиновым маслом, - об окислительном процессе (O), а сохранение исходного неизменного цвета в обеих пробирках - об отсутствии активности в отношении глюкозы (-).

Тест на цитохромоксидазу можно проводить по методу Эрлиха, для чего на поверхность роста 18 - 20-часовой агаровой культуры наносят каплю 1-процентного водного раствора диметил-пара-фенилендиамина и добавляют каплю 1-процентного спиртового раствора альфа-нафтола. При положительной реакции через 1 - 3 минуты появляется ярко-синее окрашивание. Тест можно воспроизвести также с помощью диска на цитохромоксидазу из коммерческой бумажной индикаторной системы (СИБ) в соответствии с наставлением к нему. Наличие цитохромоксидазы можно выявить по методу Ковача (известен как тест на оксидазу), являющемуся модификацией метода Эрлиха. По методу Ковача на культуру наносят несколько капель 1-процентного водного раствора тетра-пара-фенилендиамина. При положительной реакции через 20 - 30 секунд появляется стойкое темно-красное окрашивание.

Тест на редукцию нитратов проводят путем посева одной петли суточной агаровой культуры в питательную среду, содержащую нитрат калия (см. "Питательные среды и реактивы"), и инкубируют при 37 °C до 4 суток с ежедневным учетом реакции. Для выявления восстановленных нитритов в пробирку с культуральной жидкостью вносят по 1 мл растворов А и Б (см. "Питательные среды и реактивы"). При положительной реакции через несколько минут появляется красное окрашивание, при отрицательной цвет среды не меняется.

2.3.2. Дифференциация родов

Небольшое число признаков, выявляемых у культур энтеробактерий на этапе первичной идентификации, не позволяет достоверно определить их родовую принадлежность. Обычно по сочетанию биохимических признаков на средах первичной идентификации (на комбинированных) можно заподозрить одновременно несколько (3 - 6) родов энтеробактерий. В связи с этим для установления родовой принадлежности изучаемой культуры следует провести дифференциацию родов, т.е. использовать соответствующие тесты из минимального дифференцирующего ряда (табл. 7). Конкретный набор тестов определяют с учетом родов, подлежащих дифференциации (табл. 5). При затруднениях в дифференциации прибегают к определению дополнительных признаков у изучаемой культуры, используя данные о биохимических характеристиках родовых групп семейства Enterobacteriaceae (табл. 8).

Таблица 7

--------------------------------

<*> Температура указана по Цельсию (C).

<**> Приведены свойства, характерные для K. pneumoniae.

<***> Приведены свойства без T. pestis.

<****> Приведены свойства, характерные для Erwinia herbicola.

Примечание: * - не изучено.

Воспроизведение тестов минимального дифференцирующего ряда требует соблюдения известных правил.

При определении подвижности посев культуры следует делать уколом петлей или иглой по центру столбика полужидкого СПА (0,3 - 0,4%), не доходя до дна пробирки.

Индолообразование определяют путем добавления реактивов Эрлиха или Ковача к культуре, выращенной в безуглеводной среде - пептонной воде (1 - 2%), бульоне Хоттингера, бульоне на триптическом переваре казеина. Вместо растворов реактивов Эрлиха или Ковача можно использовать пропитанную одним из них полоску фильтровальной бумаги (индикаторная бумажка "на индол"), которую помещают между стенкой и пробкой пробирки с культурой, выращенной в какой-либо из указанных сред или в полужидком агаре, используемом для определения подвижности. Все указанные для определения индолообразования питательные среды следует предварительно проверять с тест-культурами, образующими индол.

Для выявления фенилаланиндезаминазы делают массивный посев штрихом по

скошенной части соответствующей среды и после 18 - 24 часов инкубации на

выросшую культуру наносят несколько капель 10% раствора железа (III)

хлорида (FeCl ).

При определении декарбоксилаз лизина и орнитина, дигидролазы аргинина наряду с посевами в среды с этими аминокислотами необходимо делать посев в контрольную пробирку, содержащую основу без аминокислоты. После посевов во все пробирки, включая контрольную, вносят стерильное вазелиновое масло слоем 4 - 5 мм.

Тесты со средами Симонса и ацетатной выявляют способность испытуемых культур использовать цитрат и ацетат (соответственно) как единственные источники углерода. Для посева на эти среды берут минимальную инокулирующую дозу, снимая посевной материал без прикосновения петли к среде культивирования. Более целесообразно использовать для посева на эти среды суспензию бактериологической петли культуры в 1 - 1,5 мл ИХН, не допускается высев из бульона и других жидких питательных сред.

Для постановки тестов с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра используют среду Кларка в объеме 5 - 6 мл в пробирке, посев делают обычным способом. Первоначальный учет проводят через сутки, для чего по 1 мл культивированной жидкости переносят в две пробирки, в одну из которых добавляют 1 - 2 капли реактива метилового красного, а во вторую - последовательно 0,5 мл 6% спиртового раствора альфа-нафтола и 0,2 мл 40% раствора KOH. Оценку результатов реакций см. табл. 9. Тест с метиловым красным учитывают сразу после добавления реактива, а тест Фогеса - Проскауэра - в течение 5 - 10 минут после встряхивания или после 1 - 2 часов пребывания в термостате. Пробирку с неиспользованной культурой в среде Кларка продолжают инкубировать в термостате до 2 - 4 суток, когда указанные реакции дают более четкие результаты. Для некоторых энтеробактерий (например, гафний) результаты реакций с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра различны при разных температурах культивирования (22° или 37 °C), что может быть использовано в качестве дополнительного дифференцирующего теста.

Таблица 9

РЕЗУЛЬТАТЫ ОСНОВНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

НА КОМБИНИРОВАННЫХ СРЕДАХ И МИНИМАЛЬНОМ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕМ

РЯДЕ

┌─────────────────┬────────────────────────────────────────────────────┬────────────┐

│Тест или субстрат│Реакция через 18 - 24 часа культивирования при 37 °C│Максимальные│

│ ├─────────────────────────┬──────────────────────────┤сроки учета │

│ │ положительная │ отрицательная │результатов │

│ │ │ │ в случаях │

│ │ │ │замедленных │

│ │ │ │ реакций │

│ │ │ │ (в сутках) │

├─────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────────────┼────────────┤

│Подвижность │помутнение среды, │среда остается прозрачной,│2 (с инкуба-│

│ │диффузное или в отдельных│рост строго по ходу укола │цией посевов│

│ │участках вдоль укола │ │при 22 °C) │

│Сероводород (в │почернение в разной сте- │отсутствие почернения в │ │

│среде Олькеницко-│пени по всей среде или в │среде │ │

│го или Клиглера) │отдельных участках │ │ │

│Индол (с примене-│покраснение индикаторной │отсутствие изменения цвета│ │

│нием индикаторной│бумажки │индикаторной бумажки │ │

│бумажки) │ │ │ │

│Фенилаланиндеза- │зеленое окрашивание │отсутствие изменения цвета│ │

│миназа │агаровой поверхности │ │ │

│ │среды после добавления │ │ │

│ │нескольких капель 10% │ │ │

│ │раствора железа (III) │ │ │

│ │хлорида (FeCl ) │ │ │

│ │ 3 │ │ │

│Мочевина по │синее окрашивание среды │пожелтение среды │2 │

│Преусу <*> │ │ │ │

│Мочевина по │малиновое окрашивание │отсутствие изменения цвета│4 │

│Кристенсену │среды │ │ │

│Ацетат натрия <*>│наличие роста и синее │отсутствие роста и │4 (редко до │

│ │окрашивание среды │изменения цвета среды │7) │

│Цитрат Симонса │наличие роста и синее │отсутствие роста и │4 (редко до │

│<*> │окрашивание среды │изменения цвета среды │14) │

│Реакция с │красное окрашивание среды│желтое окрашивание среды │2 - 4 │

│метиловым красным│после добавления реактива│после добавления реактива │ │

│в среде Кларка │метилового красного │метилового красного │ │

│Реакция Фогеса - │вишневое окрашивание │отсутствие изменения цвета│2 - 4 │

│Проскауэра │среды после добавления │среды после добавления │ │

│ │реактивов (альфа-нафтола │реактивов (альфа-нафтола и│ │

│ │и KOH) │KOH) │ │

│Среды с аминокис-│синее (при индикаторе │отсутствие синего (фиоле- │4 │

│лотами (лизином, │бромтимол синий) или │тового) окрашивания сред с│ │

│орнитином, │фиолетовое (при индикато-│аминокислотами, желтое │ │

│аргинином) │ре бромкрезол пурпуровый)│окрашивание в контрольной │ │

│ │окрашивание среды при │пробирке │ │

│ │отсутствии указанных │ │ │

│ │окрашиваний в контрольной│ │ │

│ │пробирке │ │ │

│Малонат натрия │синее окрашивание среды │отсутствие изменения цвета│2 │

│<*> │ │ │ │

│Цитрат │розово-красное │отсутствие изменения цвета│4 │

│Кристенсена │окрашивание среды │ │ │

│Желатин │разжижение среды, не │отсутствие разжижения │30 │

│ │исчезающее после часового│среды или его исчезновение│ │

│ │охлаждения в рефрижерато-│после часового охлаждения │ │

│ │ре (4 - 6 °C) │в рефрижераторе (4 - 6 °C)│ │

│Среды с │синее или розовое, │отсутствие изменения цвета│30 │

│углеводами │красное (в зависимости от│ │ │

│ │индикатора) окрашивание │ │ │

│ │среды │ │ │

└─────────────────┴─────────────────────────┴──────────────────────────┴────────────┘

--------------------------------

<*> Указаны изменения цвета при индикаторе бромтимоловый синий.

Посевы для воспроизведения других тестов не требует специальных пояснений, учет результатов см. табл. 9.

На этапе дифференциации родов могут быть использованы пробы с поливалентными сальмонеллезными и дизентерийным бактериофагами (диагностические жидкие или лечебные в таблетках). Таблетку лечебного фага перед постановкой пробы растворяют в 20 мл ИХН. Для воспроизведения пробы с фагом используют 2-х или 18-часовую бульонную культуру, можно применять также взвесь суточной агаровой культуры в ИХН. Тонко оттянутой пастеровской пипеткой или петлей диаметром 4 - 5 мм наносят две капли испытуемой культуры на хорошо подсушенный СПА в чашке Петри. На одну из капель после подсыхания наносят петлей или из очень тонкого капилляра пастеровской пипетки каплю фага, а на другую (служащую контролем) - каплю стерильного бульона. Бактериофаг применяют в неразведенном виде или в разведениях в соответствии с "Наставлением" к препарату. После постановки пробы чашки инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 часов. При положительной реакции на месте нанесения фага появляется четко очерченный лизис (++++), полусливной лизис (+++), большее или меньшее число отдельных негативных колоний (++, +). При отсутствии лизиса (отрицательная реакция) в местах нанесения фага, как и в контроле, наблюдают сплошной рост культуры.

Как указывалось ранее, на этапе дифференциации родов возможна постановка ориентировочных серологических проб с поливалентными агглютинирующими сыворотками к сальмонеллам и шигеллам. При этом используют соответственно поливалентную смесь к сальмонеллам групп ABCDE (при отрицательном результате пробу повторяют со смесью O-сывороток к сальмонеллам редких групп) и поливалентную смесь сывороток к S. sonnei, S. flexneri 1 - 5, S. flexneri 6. Указанные ориентировочные пробы выполняют путем постановки реакции агглютинации на стекле с культурой, выросшей на среде первичной идентификации. В ходе исследования на ЭПЭ, как указывалось ранее, при отборе соответствующих колоний, давших агглютинацию с OKA сывороткой, делают посев не только на среду первичной идентификации, но и на скошенный СПА. Серологическое изучение эшерихий проводят с культурами, выращенными на скошенном СПА. Культуры, подозреваемые на принадлежность к ЭПЭ, исследуют повторно с поливалентной сывороткой OKA и при положительном результате с OKB, OKC, OKD, OKE или соответствующими OK-иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуру засевают в среды минимального дифференцирующего ряда (табл. 7) для подтверждения принадлежности культуры к роду Escherichia (в первую очередь ацетатную, цитратную Кристенсена и на подвижность).

Помимо постановки тестов, необходимых для установления родовой принадлежности выделенной культуры энтеробактерий, со среды первичной идентификации делают также высев на скошенный СПА, используемый для дальнейшей биохимической и серологической идентификации.

2.3.3. Идентификация видов и внутривидовая дифференциация

Идентификация видов и внутривидовая дифференциация энтеробактерий составляет заключительный этап бактериологического исследования различных материалов. В большинстве случаев идентификация видов энтеробактерий предусматривает применение дополнительных к использованным на предыдущем этапе (определения рода) биохимических тестов из минимального дифференцирующего ряда.

Для патогенных, а также для некоторых условно патогенных энтеробактерий, идентификация включает, кроме биохимической, и серологическую характеристику. Последняя обеспечивает тонкую дифференциацию энтеробактерий вплоть до определения серовидов и подсеровидов (например, для Shigella flexneri).

Другие возможности внутривидовой дифференциации, основывающиеся на особенностях взаимодействия с препаратами бактериофагов, на феномене колициногении или определении биоваров реализуются при наличии соответствующих эпидемиологических показаний и изложены в следующем разделе "Методических указаний".

Род Shigella в соответствии с действующей в СССР Международной классификацией разделен на 4 подгруппы (A, B, C, D), соответствующие видам: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (табл. 10).

Таблица 10

КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА SHIGELLA <*>

--------------------------------

<*> Приведена принятая в СССР Международная классификация шигелл с учетом внесенных в нее в 1982 г. Международным подкомитетом по энтеробактериям изменений и дополнений:

1) вид S. dysenteriae дополнен сероварами 11 и 12, ранее известными как провизорные (временные) серовары 3873-50 и 3341-55 соответственно;

2) серовар 3 S. flexneri включают ныне два подсеровара - 3a и 3b;

3) серовар 5 S. flexneri разделен на подсеровары 5a и 5b;

4) вид S. boydii дополнен сероварами 16, 17 и 18, ранее известными как провизорные серовары 2710-54, 3615-53 и E10163 соответственно.

┌─────────┬──────────────┬─────────┬──────────┬──────────────────┐

│Подгруппа│ Вид │ Серовар │Подсеровар│ Сокращенная │

│ │ │ │ │антигенная формула│

├─────────┼──────────────┼─────────┼──────────┼──────────────────┤

│A │S. dysenteriae│1 - 12 │ │ │

│B │S. flexneri │1 │1a │I:4... │

│ │ │ │1b │I:6... │

│ │ │2 │2a │II:3,4... │

│ │ │ │2b │II:7,8... │

│ │ │3 │3a │III:(3,4),6,7,8...│

│ │ │ │3b │III:(3,4),6... │

│ │ │4 <**> │4a │IV:3,4... │

│ │ │ │4b │IV:6... │

│ │ │5 │5a │V:3,4... │

│ │ │ │5b │V:7,8... │

│ │ │6 │- │VI:... │

│ │ │X-variant│- │-:7,8... │

│ │ │Y-variant│- │-:3,4... │

│C │S. boydii │1 - 18 │- │ │

│D │S. sonnei │- │- │ │

└─────────┴──────────────┴─────────┴──────────┴──────────────────┘

--------------------------------

<**> С конца 70-х годов в СССР стали выделяться S. flexneri 4 с антигенной формулой (IV:7,8), не предусмотренной Международной классификацией шигелл.

Основные тесты для дифференциации указанных видов представлены в табл. 11, а для их внутривидовой дифференциации в табл. 12 - 14.

Таблица 11

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ SHIGELLA ПО БИОХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ

┌─────────────┬─────────────┬────────────────┬─────────┬─────────┐

│ Тест или │S. dysente- │ S. flexneri │S. boydit│S. sonnei│

│ субстрат │riae ├────────┬───────┤ │ │

│ │ │серовары│серовар│ │ │

│ │ │ 1 - 5 │ 6 │ │ │

├─────────────┼─────────────┼────────┼───────┼─────────┼─────────┤

│Маннит │- │+ │+, - │+ │+ │

│Глюкоза (газ)│- │- │-, + │- <**> │- │

│Лактоза │- │- │- │- <**> │(+) │

│Индол │-, + │-, + │- │-, + │- │

│Глицерин │X │- │+, (+) │+, (+) │X │

│Орнитин │- │- │- │- <**> │+, (+) │

│Сорбит │X │X │X │X │- │

│Дульцит │- <*> │- │X │X │- │

│Ксилоза │X │- │X │X │X │

│Рафиноза │- │ │- │- │X │

└─────────────┴─────────────┴────────┴───────┴─────────┴─────────┘

--------------------------------

<*> S. dysenteriae 5 ферментируют дульцит.

<**> S. boydii 6 и 14 могут образовывать газ, S. boydii 13 декарбоксилируют орнитин, S. boydii 9 могут замедленно ферментировать лактозу.

Таблица 12

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СЕРОВАРОВ S. DYSENTERIAE

┌────────┬────────┬────────┬────────┬─────────┬────────┬─────────┐

│Серовар │ Индол │Дульцит │Рамноза │ Ксилоза │ Сорбит │Арабиноза│

├────────┼────────┼────────┼────────┼─────────┼────────┼─────────┤

│1 │- │- │- │- │- │-, + │

│2 │+ │- │+ │- │X │-, + │

│3 │- │- │- │- │+, (+) │+, (+) │

│4 │- │- │- │- │-, (+) │-, + │

│5 │- │+, (+) │- │- │+, (+) │+ │

│6 │- │- │- │- │+, (+) │-, + │

│7 │+ │- │-, (+) │- │- │+ │

│8 │+ │- │- │+ │- │+ │

│9 │- │- │- │-, (+) │-, + │+ │

│10 │- │- │- │+ │+, (+) │+ │

│11 │- │- │- │(+) │(+) │+ │

│12 │- │- │-, + │(+) │(+) │+ │

└────────┴────────┴────────┴────────┴─────────┴────────┴─────────┘

Таблица 13

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СЕРОВАРОВ S. FLEXNERI

┌───────────────┬───────────────┬────────────────┬───────────────┐

│ Серовар │ Индол │ Сорбит │ Рамноза │

├───────────────┼───────────────┼────────────────┼───────────────┤

│1 │-, + │-, + │- │

│2 │-, + │-, + │- │

│3 │+, - │X │X │

│4 │+, - │X │X │

│5 │+, - │X │- │

│X-variant │+, - │+, - │-, (+) │

│Y-variant │-, + │-, + │-, (+) │

└───────────────┴───────────────┴────────────────┴───────────────┘

Таблица 14

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СЕРОВАРОВ S. BOYDII

┌────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬────────────┐

│ Серовар │ Индол │ Дульцит │ Ксилоза │ Сорбит │

├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┤

│1 │- │- │(+), + │(+), + │

│2 │- │- │- │-, (+) │

│3 │- │X │X │+ │

│4 │- │-, (+) │- │X │

│5 │+ │- │(+) │+, (+) │

│6 │- │(+) │+ │+, (+) │

│7 │+ │- │+ │+, (+) │

│8 │- │- │X │+, (+) │

│9 │+ │- │- │+, (+) │

│10 │- │X │X │X │

│11 │+ │-, (+) │+, (+) │X │

│12 │- │- │- │X │

│13 │+ │- │- │+, (+) │

│14 │- │- │(+), + │+, (+) │

│15 │+ │- │- │+, (+) │

│16 │+ │- │+ │- │

│17 │+ │- │+ │+, (+) │

│18 │- │- │(+) │(+) │

└────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴────────────┘

Серологическую идентификацию шигелл проводят с помощью адсорбированных сывороток. Исследование начинают с основной поливалентной сыворотки, содержащей антитела к S. flexneri 1 - 6 и S. sonnei. При положительном результате далее используют поливалентные сыворотки к S. flexneri 1 - 5, S. sonnei (I и II фаза) и сыворотку к S. flexneri 6 (с учетом этиологической структуры дизентерии в данной местности). Учитывают и данные о биохимических свойствах выделенной культуры шигелл: например, шигеллы, образующие индол, не следует агглютинировать в сыворотках к S. sonnei и к S. flexneri 6 (S. newcastle).

Установление антигенной формулы S. flexneri (см. табл. 10) начинают с применения сероварспецифических сывороток (к антигенам I, II, III, IV, V, VI), а затем групповых (3, 4; 6; 7, 8). Порядок исследования также зависит от пейзажа сероваров шигелл в регионе. При работе с культурами S. flexneri надо помнить, что иногда свежевыделенные штаммы слабо агглютинируются, особенно в сыворотке к групповым антигенам 3, 4. В таких случаях следует для повышения агглютинабельности провести 1 - 2 пассажа 4-часовой бульонной культуры с высевом на скошенный СПА. Если культура агглютинирует в сыворотке к S. sonnei, серологическая ее идентификация считается завершенной.

Бактерии, принадлежащие по культуральным и биохимическим свойствам к шигеллам, но не агглютинирующиеся в основной поливалентной сыворотке, испытывают с поливалентными сыворотками к другим видам шигелл: к S. dysenteriae (если они не сбраживают маннит) или к S. boydii (в случае маннитферментирующих штаммов). При положительной реакции в одной из примененных сывороток культуру испытывают с сероварспецифическими сыворотками, входящими в данную поливалентную смесь.

Некоторые шигеллы (S. dysenteriae, S. flexneri 6, S. boydii) могут иметь хорошо развитые Y-антигенны, вследствие чего живые культуры не агглютинируются в соответствующих сыворотках. Взвеси таких культур в ИХН следует прогреть в водяной бане при 100 °C в течение 1 часа. При этом обязателен контроль культуры до кипячения на спонтанную агглютинацию в капле ИХН, для ее исключения.

В случаях каких-либо затруднений при серологической идентификации шигелл необходимо провести рассев штамма в чашке с дифференциальной средой (ЭМС или Эндо) с целью проверки чистоты культуры и повторно провести биохимическую идентификацию.

Род Salmonella согласно Определителю Берги (1980) состоит из четырех подродов (см. табл. 1), дифференциацию которых проводят с использованием биохимических тестов, приведенных в табл. 15.

Таблица 15

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОДРОДОВ SALMONELLA

ПО БИОХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ

┌────────────────────┬───────────────────────────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ Подроды │

│ ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤

│ │ I │ II │ III │ IV │

├────────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│Дульцит │+ │+ │- │- │

│Лактоза │- │- │X │- │

│Салицин │- │- │- │+ │

│Малонат натрия │- │+ │+ │- │

└────────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┘

Дальнейшую идентификацию представителей рода Salmonella проводят согласно антигенно-диагностической схеме Кауфмана-Уайта (табл. 16) с применением коммерческих агглютинирующих сывороток. Как указывалось ранее (см. схему 1) ориентировочная проба в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой к сальмонеллам O-групп ABCDE (к антигенам 2, 4, 7, 8, 9, 3, 10), а при ее отрицательном результате и с поливалентной сывороткой к сальмонеллам редких O-групп (к антигенам 11, 18, 14, 16, 17, 23 и др.) возможна еще на этапе определения рода. После подтверждения биохимическими тестами принадлежности выделенной культуры к роду Salmonella реакции с поливалентными сыворотками повторяют и переходят к определению O-групп сальмонелл (по схеме Кауфмана-Уайта) с помощью отдельных O-сывороток, входящих в соответствующую поливалентную.

Таблица 16

СХЕМА КАУФМАНА-УАЙТА (СОКРАЩЕННАЯ)

┌──────┬─────────────────────────┬─────────────────┬──────────────────────┐

│Группа│ Серовар │ O-антиген │ H-антиген │

│ │ │ ├────────────┬─────────┤

│ │ │ │ 1 фаза │ 2 фаза │

├──────┼─────────────────────────┼─────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │

│A │S. paratyphi A │1, 2, 12 │a │(1, 5) │

│B │S. kisangani │1, 4, (5), 12 │a │1, 2 │

│ │S. arechavaleta │4, (5), 12 │a │(1, 7) │

│ │S. bispebjerg │1, 4, (5), 12 │a │e, n, x │

│ │S. schleiasheim │4, 12, 27 │b │- │

│ │S. paratyphi B │1, 4, (5), 12 │b │1, 2 │

│ │S. java │1, 4, (5), 12 │b │(1, 2) │

│ │S. abony │1, 4, (5), 12, 27│b │e, n, x │

│ │S. abortusbovis │1, 4, 12, 27 │b │e, n, x │

│ │S. wagenia │1, 4, 12, 27 │b │e, n, z15│

│ │S. wien │1, 4, 12, 27 │b │l, w │

│ │S. abortusovis │4, 12 │c │1, 6 │

│ │S. altendorf │4, 12, 27 │c │1, 7 │

│ │S. stanley │1, 4, (5), 12, 27│d │1, 2 │

│ │S. saintpaul │1, 4, (5), 12 │e, h │1, 2 │

│ │S. reading │1, 4, (5), 12 │e, h │1, 5 │

│ │S. chester │1, 4, (5), 12 │e, h │e, n, x │

│ │S. san-diego │4, (5), 12 │e, h │e, n, z15│

│ │S. derby │1, 4, (5), 12 │f, g │(1, 2) │

│ │S. agona │1, 4, 12 │f, g, s │- │

│ │S. essen │4, 12 │g, m │- │

│ │S. budapest │1, 4, 12, 27 │g, t │- │

│ │S. typhimurium │1, 4, (5), 12 │i │1, 2 │

│ │S. agama │4, 12 │i │1, 6 │

│ │S. texas │4, (5), 12 │k │e, n, z15│

│ │S. azteca │4, (5), 12, 27 │l, v │1, 5 │

│ │S. bredeney │1, 4, 12, 27 │l, v │1, 7 │

│ │S. brandenburg │1, 4, 12 │l, v │e, n, z15│

│ │S. heidelberg │1, 4, (5), 12 │r │1, 2 │

│ │S. bradford │4, 12, 27 │r │1, 5 │

│ │S. africana │4, 12 │r, i │l, w │

│ │S. stanleyville │1, 4, (5), 12, 27│z4, z23 │(1, 2) │

│ │S. haifa │1, 4, (5), 12 │z10 │1, 2 │

│ │S. shubra │4, (5), 12 │z │1, 2 │

│C │S. paratyphi C │6, 7 (vi) │c │1, 5 │

│ 1 │S. choleraesuis │6, 7 │ │1, 5 │

│ │var. kunsendorf │ │ │ │

│ │S. cholerae-suis │6, 7 │c │1, 5 │

│ │S. mission │6, 7 │d │1, 5 │

│ │S. isangi │6, 7 │d │1, 5 │

│ │S. norwich │6, 7 │e, h │1, 6 │

│ │S. braenderup │6, 7 │e, h │e, n, z15│

│ │S. montevideo │6, 7 │g, m, (p), s│(1, 2, 7)│

│ │S. oranienburg │6, 7 │m, t │- │

│ │S. garoli │6, 7 │i │1, 6 │

│ │S. thompson │6, 7 │k │1, 5 │

│ │S. concord │6, 7 │l, v │1, 2 │

│ │S. irumu │6, 7 │l, v │1, 5 │

│ │S. potsdam │6, 7 │l, v │e, n, z15│

│ │S. virchow │6, 7 │r │1, 2 │

│ │S. infantis │6, 7 │r │1, 5 │

│ │S. nigeria │6, 7 │r │1, 6 │

│ │S. papuana │6, 7 │r │e, n, z15│

│ │S. bareilly │6, 7 │y │1, 5 │

│ │S. tosamanga │6, 7 │z │1, 5 │

│ │S. tennessee │6, 7 │z29 │(1, 2, 7)│

│C │S. muenchen │6, 8 │d │1, 2 │

│ 2 │S. manhattan │6, 8 │d │1, 5 │

│ │S. newport │6, 8 │e, h │1, 2 │

│ │S. kottbus │6, 8 │e, h │1, 5 │

│ │S. tshiongwe │6, 8 │e, h │e, n, z15│

│ │S. sandow │6, 8 │f, g │e, n, z15│

│ │S. manchester │6, 8 │l, v │1, 7 │

│ │S. bovismorbificans │6, 8 │r │1, 5 │

│ │S. hidalgo │6, 8 │r │e, n, z15│

│ │S. chailey │6, 8 │z4, z23 │e, n, z15│

│ │S. glostrup │6, 8 │z10 │e, n, z15│

│C │S. virginia │8 │d │1, 2 │

│ 3 │S. kentucky │8, 20 │i │z6 │

│D │S. sendai │1, 9, 12 │a │1, 5 │

│ 1 │S. alabama │9, 12 │c │e, n, z15│

│ │S. typhi │9, 12, (vi) │d │- │

│ │S. eastborne │1, 9, 12 │e, h │1, 5 │

│ │S. enteritidis │1, 9, 12 │g, m │(1, 7) │

│ │S. dublin │1, 9, 12, (vi) │g, p │- │

│ │S. rostock │1, 9, 12 │g, p, u │- │

│ │S. moscow │9, 12 │g, q │- │

│ │S. pensacola │1, 9, 12 │m, t │- │

│ │S. mendoza │9, 12 │l, v │1, 2 │

│ │S. panama │1, 9, 12 │l, v │1, 5 │

│ │S. kapamba │9, 12 │l, v │1, 7 │

│ │S. daressalam │1, 9, 12 │l, w │e, n, x │

│ │S. gallinarumpullorum <*>│1, 9, 12 │- │- │

│E │S. oxford │3, 10 │a │1, 7 │

│ 1 │S. butantan │3, 10 │b │1, 5 │

│ │S. vejle │3, 10 │e, h │1, 2 │

│ │S. muenster │3, 10 │e, h │1, 5 │

│ │S. anatum │3, 10 │e, h │1, 6 │

│ │S. nyborg │3, 10 │e, h │1, 7 │

│ │S. newlands │3, 10 │e, h │e, n, x │

│ │S. meleagridis │3, 10 │e, h │l, w │

│ │S. westhampton │3, 10 │g, s, t │- │

│ │S. zanzibar │3, 10 │k │1, 5 │

│ │S. nchanga │3, 10 │l, v │1, 2 │

│ │S. london │3, 10 │l, v │1, 6 │

│ │S. give │3, 10 │(d), l, v │1, 7 │

│ │S. uganda │3, 10 │l, z13 │1, 5 │

│ │S. seegefeld │3, 10 │r, i │1, 2 │

│ │S. elisabethville │3, 10 │r │1, 7 │

│ │S. simi │3, 10 │r │e, n, z15│

│ │S. amager │3, 10 │y │1, 2 │

│ │S. lexington │3, 10 │z10 │1, 5 │

│E │S. newington │3, 15 │e, h │1, 6 │

│ 2 │S. selandia │3, 15 │e, h │1, 7 │

│E │S. senftenberg │1, 3, 19 │g, (s), t │- │

│ 4 │ │ │ │ │

│F │S. aberdeen │11 │i │1, 2 │

│G │S. poona │1, 13, 22 │z │1, 6 │

│ 1 │ │ │ │ │

│J │S. kirkee │17 │b │1, 2 │

│K │S. usumbura │18 │d │1, 7 │

│N │S. urbana │30 │b │e, n, x │

│O │S. adelaide │35 │f, g │- │

│P │S. inverness │38 │k │1, 6 │

│S │S. lethe │41 │g, t │- │

│ │S. waycross │41 │z4, z23 │- │

│ │S. negev │41 │z10 │1, 2 │

│U │S. houten │43 │z4, z23 │- │

│V │S. niarembe │44 │a │l, w │

│X │S. kaolack │47 │z │1, 6 │

│53 │S. number │53 │z4, z24 │- │

└──────┴─────────────────────────┴─────────────────┴────────────┴─────────┘

--------------------------------

<*> Объединяет два биосеровара: S. gallinarum и pullorum.

Подрод I включает большинство известных сероваров сальмонелл, к подроду II и IV относят редко встречающиеся серовары. К подроду III отнесены бактерии, ранее известные как бактерии Arizona, принадлежащие к различным сероварам.

Сальмонеллы первого подрода варьируют по некоторым биохимическим свойствам, основные из которых приведены в табл. 17.

Таблица 17

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАИБОЛЕЕ ЧАСТО

ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ СЕРОВАРОВ

┌───────────────────┬─────┬────┬─────┬────┬────┬───────┬───────┬────┬─────┐

│ Серовары │Глю- │Ино-│Ара- │Рам-│Ком-│Глице- │Цитрат │D- │Серо-│

│ │коза │зит │бино-│ноза│лоза│рин (по│Крис- │тар-│водо-│

│ │(газ)│ │за │ │ │Штерну)│тенсена│трат│род │

├───────────────────┼─────┼────┼─────┼────┼────┼───────┼───────┼────┼─────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │ 10 │

│ ГРУППА A │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. paratyphi A │+ │- │+ │+ │- │- │- │- │X │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ ГРУППА B │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. paratyphi B │+ │X │+ │X │+ │X │+ │- │+ │

│S. java │+ │X │+ │X │+ │X │+ │+ │+ │

│S. abony │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. stanley │+ │- │+ │+ │+ │X │+ │+ │+ │

│S. derby │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. agona │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. typhimurium │X │X │X │X │X │X │X │X │X │

│S. reading │+ │X │+ │X │+ │X │+ │+ │+ │

│S. heidelberg │+ │X │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. stanleyville │+ │X │+ │+ │+ │X │+ │+ │+ │

│S. haifa │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ ГРУППА C │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. paratyphi C │+ │- │X │+ │+ │- │+ │+ │+ │

│S. choleraesuis │+ │- │- │+ │+ │- │+ │+ │X │

│ var. kunsendorf │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. typhisuis │+ │- │- │+ │+ │- │+ │+ │X │

│S. montevideo │+ │- │+ │+ │+ │- │- │- │- │

│S. thompson │+ │X │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. mission │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. isangi │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. virchow │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. infantis │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. tennessee │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ ГРУППА C │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ 2 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. muenchen │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. newport │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │X │+ │

│S. bovismorbificans│+ │X │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. kottbus │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. tshiongwe │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ ГРУППА D │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. typhi │- │- │X │- │X │- │X │+ │X │

│S. enteritidis │+ │- │+ │+ │+ │+ │X │X │+ │

│S. enteritidis │+ │- │X │+ │+ │- │X │X │+ │

│ var. ratin │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. dublin │+ │- │X │X │X │X │+ │+ │+ │

│S. panama │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │X │+ │

│S. gallinarum- │X │- │+ │+ │X │- │X │X │X │

│pullorum │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. rostock │+ │- │+ │- │+ │- │+ │+ │+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ ГРУППА E │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│S. anatum │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. london │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. give │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. newington │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│S. senftenberg │+ │- │+ │+ │+ │X │+ │+ │X │

└───────────────────┴─────┴────┴─────┴────┴────┴───────┴───────┴────┴─────┘

После установления принадлежности культуры к O-группе определяют полную

структуру ее O-антигенов, а затем испытывают с монорецепторами

H-сыворотками также в реакции агглютинации на стекле, начиная исследование

с сывороток к наиболее распространенным в данной местности сероварам

сальмонелл. После выявления H-антигена первой фазы определяют антигенные

компоненты второй фазы и устанавливают полную антигенную формулу (серовар)

выделенной культуры. Для определения антигенной формулы некоторых сероваров

из групп C и D культуру испытывают с vi-сывороткой для выявления

1 1

vi-антигена (S. typhi, S. dublin и S. paratyphi C /S. hirschfeldii/).

Для реакции агглютинации с O-сывороткой следует брать культуру с верхней части скошенного агара, для H-сывороток - конденсат или из нижнего участка роста (наиболее подвижные особи). При отсутствии четкой реакции агглютинации с O-сывороткой проводят пассажи культуры (4 - 5 раз) на 10-процентном желчном бульоне и скошенном СПА с последующим рассевом на чашки с СПА и отбором отдельных колоний. При серологической идентификации возможны трудности в определении H-антигена или одной из его фаз, что может быть связано с угнетением или утратой H-антигена (утрата подвижности), либо с преобладанием в популяции особей с преимущественным содержанием какой-либо одной фазы. Для некоторых сальмонелл характерно отсутствие H-антигена (S. gallinarum - S. pullorum) или отсутствие первой фазы H-антигена (S. choleraesuis var. kunsendorf и др.).

Для выявления искомой фазы H-антигена используют феномен роения по Гарду, для чего применяют мягкий (0,8 - 1%) СПА в чашках. В центре чашки с СПА наносят 1 - 2 капли агглютинирующей сыворотки, соответствующей выявленной фазе, после подсыхания сыворотки на тот же участок сеют "бляшкой" (диаметр 3 - 4 мм) 18 - 20-часовую агаровую культуру. Распространение бактерий, богатых H-антигеном этой фазы, будет угнетено, в то время как особи бактерий, содержащие преимущественно другую (не выявленную) фазу, будут распространяться на поверхности мягкого агара за пределом "бляшки" (макроколонны). С периферии такой макроколонны берут бактериологической петлей материал и испытывают в реакции агглютинации на стекле с различными H-сыворотками.

Для определения невыявленной фазы H-антигена можно использовать также U-образную трубочку, заполненную полужидким (0,2 - 0,4%) СПА, смешанным с H-сывороткой подавляемой фазы. Для выявления наиболее подвижных особей в слабоподвижной или неподвижной культуре используют также U-образную трубочку с полужидким агаром, но без добавления сыворотки. Для отбора подвижных особей исследуют культуру из противоположного (от посева) колена трубочки.

В некоторых случаях для дифференциации биоваров Salmonella с одинаковой антигенной формулой необходимо определение дополнительных биохимических свойств (табл. 18).

Таблица 18

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ SALMONELLA С ОДНОТИПНОЙ АНТИГЕННОЙ

СТРУКТУРОЙ ПО БИОХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ

┌───────────────────┬────────────────────────┬───────────────────┐

│ Серовар │ Антигенная структура │ Биохимические │

│ │ │ свойства │

├───────────────────┼────────────────────────┼───────────────────┤

│S. paratyphi B │1, 4, 5, 12; b; 1, 2 │ ацетат - │

│(S. schottmuelleri)│ │D-тартрат - │

│S. java │1, 4, 5, 12; b; 1, 2 │ ацетат + │

│ │ │D-тартрат + │

├───────────────────┼────────────────────────┼───────────────────┤

│S. mission │6, 7; d; 1, 5 │ инозит - │

│S. isangi │6, 7; d; 1, 5 │ инозит + │

├───────────────────┼────────────────────────┼───────────────────┤

│S. choleraesuis │6, 7; c; 1, 5 │ арабиноза - │

│ │ │ трегалоза - │

│ │ │D-тартрат + │

├───────────────────┼────────────────────────┼───────────────────┤

│S. typhisuis │6, 7; c; 1, 5 │ арабиноза + │

│ │ │ трегалоза + │

│ │ │D-тартрат - │

├───────────────────┼────────────────────────┼───────────────────┤

│S. enteritidis │1, 9, 12 │ глицерин │

│var. jena │ │ (б-он Штерна) + │

│S. enteritidis │1, 9, 12 │ глицерин │

│var. ratin │ │ (б-он Штерна) - │

└───────────────────┴────────────────────────┴───────────────────┘

Род Escherichia представлен одним видом E. coli, объединяющим все ранее известные биовары, включая Alcalescens - Dispar. Особенность рода состоит в том, что непатогенные разновидности эшерихий являются постоянными обитателями кишечника человека, животных, птиц и широко распространены в природе.

Патогенные эшерихии, входящие в этот же род, не отличаются от непатогенных по морфологическим и культуральным свойствам, поэтому при исследованиях на наличие патогенных эшерихий (включая ЭПЭ) изучению подлежат разнообразные по морфологическим характеристикам колонии эшерихий, выросшие на пластинчатых средах.

Основные биохимические свойства вида Escherichia coli приведены в табл. 19.

Таблица 19

ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ВИДА E. COLI

┌─────────────────────────────────────┬──────────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ Биохимические реакции │

├─────────────────────────────────────┼──────────────────────────┤

│Глюкоза (газ) │+, - │

│Лактоза │+, -, (+) <*> │

│Сероводород │- │

│Мочевина │- │

│Цитрат Симонса │- │

│Индол │+, - │

│Лизиндекарбоксилаза │+, -, (+) <*> │

│Реакция с метиловым красным │+ │

│Реакция Фогеса - Проскауэра │- │

│Малонат натрия │- │

│Ацетат натрия │+, (+) │

│Желатин │- │

│Цитрат Кристенсена │X │

│Орнитиндекарбоксилаза │X │

│Аргининдигидролаза │X │

│Фенилаланиндезаминаза │- │

│Подвижность │+, - │

│Маннит │+ │

│Инозит │-, + │

│Адонит │-, + │

│Сахароза │X │

│Арабиноза │X │

│Рафиноза │X │

│Рамноза │X │

└─────────────────────────────────────┴──────────────────────────┘

--------------------------------

<*> Последовательность обозначений реакций соответствует наблюдаемой частоте.

При исследовании на эшерихии ход анализа различен в зависимости от поставленной задачи (поиск ЭПЭ или возбудителей парентеральных эшерихиозов).

При выделении и идентификации (определение сероваров) ЭПЭ, как уже указывалось ранее, поиск и первичный отбор колоний, выросших на чашках первичного посева, проводят серологическим методом в реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки OKA (табл. 20). Оставшуюся часть колонии, давшей положительную реакцию агглютинации с сывороткой OKA, отсевают на скошенный агар и на одну из комбинированных сред для первичной идентификации. Культуры, "подозрительные" на принадлежность к роду Escherichia (по данным комбинированной среды), на следующие сутки повторно проверяют в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой OKA и при положительном результате испытывают с поливалентными сыворотками (OKB, OKC, OKD, OKE) или OK-иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуру засевают со скошенного агара в питательные среды для воспроизведения тестов минимального дифференцирующего ряда, необходимых (с учетом результатов, полученных на комбинированной среде) для подтверждения принадлежности культуры в роду Escherichia (табл. 7). Тест для определения подвижности ставят не обычным порядком (уколом в столбик полужидкого агара), а в пробирках по Крейджи (до стерилизации в бактериологическую пробирку с полужидким агаром помещают трубочку - отрезок стеклянного дрота длиной 3 - 4 см). Посев делают в верхний конец трубочки, выступающий над поверхностью агара в пробирке. Это дает возможность одновременно "накопить" материал для исследования H-антигена.

Таблица 20

СОСТАВ ПОЛИВАЛЕНТНЫХ OK-СЫВОРОТОК ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ЭШЕРИХИЙ

┌───────────────────┬────────────────────────────────────────────┐

│ Наименование │ Отдельные OK-сыворотки, входящие │

│ диагностического │ в поливалентную смесь │

│ препарата │ │

├───────────────────┼────────────────────────────────────────────┤

│OKA (антитела к 22 │018ac:K77, 020:K84, 025:K11, 026:K60, │

│серогруппам) │033:K, 044:K74, 055:K59, 075:K, 086a:K61, │

│ │0111ab:K58, 0114:K90, 0119:K69, 0124:K72, │

│ │0125:K70, 0126:K71, 0127:K63, 0128abc:K67, │

│ │0142:K86, 0143:K, 0144:K, 0151:K-, "408" │

│OKB (антитела к 4 │020:K84, 026:K60, 055:K59, 0111ab:K58 │

│серогруппам) │ │

│OKC (антитела к 7 │033:K, 086a:K61, 0119:K69, 0125:K70, │

│серогруппам) │0126:K71, 0127:K68, 0128abc:K67 │

│OKD (антитела к 9 │018ac:K77, 025:K11, 044:K74, 075:K, │

│серогруппам) │0114:K90, 0142:K86, 0143:K, 0151:K-, "408" │

│OKE (антитела к 5 │0124:K72, 0142:K86, 0148:K, 0144:K, 0151:K- │

│серогруппам) │ │

└───────────────────┴────────────────────────────────────────────┘

При получении на следующий день результатов (учет дифференциальных биохимических тестов), подтверждающих принадлежность культуры к роду Escherichia, проводят дальнейшую серологическую идентификацию для определения сероваров ЭПЭ (O-, K-, H-антигенов). Для исследования O-, K-антигенов используют суточную культуру на скошенном СПА, для исследования H-антигена с поверхности агара из пробирки Крейджи культуру засевают на скошенный глицериновый агар. Культуры эшерихий, давшие реакцию агглютинации с одной из поливалентных OK-сывороток (OKB, OKC, OKD, OKE) или иммуноглобулинами, испытывают в реакции агглютинации на стекле с отдельными групповыми OK-сыворотками, входящими в данную поливалентную смесь (табл. 20), или OK-иммуноглобулинами.

Полученный ориентировочный положительный результат с отдельной OK-сывороткой необходимо подтвердить в реакции агглютинации на стекле (табл. 21) с OK-иммуноглобулином (живые бактерии) и адсорбированными групповыми и факторными O-сыворотками (бактерии, прогретые при 100 °C в течение 30 минут).

Таблица 21

ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ЭШЕРИХИЙ В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ НА СТЕКЛЕ

┌───────────────────┬────────────────────────────────────────────┐

│Антиген для реакции│ Наименования препаратов │

│ агглютинации │ │

├───────────────────┼────────────────────────────────────────────┤

│Живая культура │Диагностические OK-эшерихиозные │

│ │иммуноглобулины: 020:K84, 025:K11, 055:K59, │

│ │0111:K58, 075:K, 0124:K72, 0142:K, 0143:K, │

│ │0144:5 │

│Гретая культура │Адсорбированные O-эшерихиозные сыворотки │

│ │групповые: 018, 020, 025, 026, 044, 055, │

│ │0111, 0112, 0124, 0142, 0143, 0144 и │

│ │факторные: 018, 018, 0112, 0112 │

└───────────────────┴────────────────────────────────────────────┘

Ответ об обнаружении определенной OK-группы ЭПЭ выдается при наличии реакции агглютинации живой культуры с соответствующим OK-иммуноглобулином или OK-сывороткой и гретой культуры с адсорбированной O-сывороткой. Исключение составляет E. coli 0151, когда положительный отчет выдают по результату агглютинации живой культуры на стекле с адсорбированной сывороткой 0151:K-. OK-иммуноглобулины как более специфичные препараты следует использовать взамен отдельных OK-сывороток. При наличии необходимого ассортимента иммуноглобулинов серологическую идентификацию ЭПЭ проводят с этими препаратами после получения положительного результата в какой-либо из поливалентных сывороток (или поливалентных иммуноглобулинов), исключая этап "ориентировочного положительного результата" с OK-сывороткой.

При отсутствии OK-иммуноглобулинов и адсорбированных O-сывороток для реакции агглютинации на стекле определение OK-группы эшерихий проводят обычным способом при помощи OK-сывороток в пробирочной реакции агглютинации с живой и прогретой (при 100 °C - 1 час) культурами. Для постановки пробирочной реакции агглютинации в объеме 1 мл делают два ряда возрастающих двукратных разведений сывороток в стерильном ИХН, начиная о разведения 1:50 до O-титра, указанного на этикетке, не принимая во внимание титр K-антител. Во все пробирки первого ряда вносят по 1 капле взвеси живых бактерий в ИХН, а второго ряда - по 2 капли той же взвеси бактерий, предварительно прогретой и охлажденной.

Контролем антигенов являются взвеси живых и прогретых бактерий в пробирках с ИХН в том же объеме, что и в разведениях сыворотки. Учет результатов проводят через 18 - 20 часов инкубации при 37 °C невооруженным глазом (живая культура) и в агглютинскопе (прогретая культура). Для живой культуры характерно образование крупнохлопчатого K-агглютината, для прогретой - мелкозернистого O-агглютината. Результат оценивают как положительный при одновременном наличии K-агглютината до титра или половины титра K-антител, указанного на этикетке, а также O-агглютината до титра или половины титра O-антител, указанного на этикетке, либо O-агглютината в обоих рядах пробирок до титра или половины титра O-антител. Последнее указывает на отсутствие K-антигена (E. coli 0151:K-) или на его потерю у штамма, принадлежащего к определенной серогруппе.

После установления OK-серогруппы у подвижных штаммов E. coli определяют серовар по H-антигену. Штаммы, предварительно пассированные на полужидком агаре в пробирке Крейджи <*>, могут быть испытаны двумя способами: в реакции агглютинации на стекле и методом иммобилизации в полученном агаре в пробирках. В обоих случаях используют коммерческие H-сыворотки, которые выпускают для метода иммобилизации. Вначале применяют поливалентные, при положительном результате - моновалентные H-сыворотки, входящие в смесь. В реакции агглютинации на стекле используют взвесь культуры, выросшей на глицериновом агаре после пассажа в пробирке Крейджи. Для получения взвеси в пробирку наливают ИХН (до верхнего края скошенного глицеринового агара), осторожно смывают культуру бактерий, вращая пробирку между ладонями. Каплю взвеси бактерий пипеткой вносят в каплю сыворотки на стекле и смешивают при покачивании. Образование агглютината указывает на положительный результат.

--------------------------------

<*> Как указывалось, посев делают уколом петли через выступающий над средой конец трубочки до дна пробирки, а высев - из верхнего слоя среды в пробирке.

Для постановки реакции иммобилизации среду готовят заранее: сыворотку смешивают с предварительно растопленным и охлажденным до 45 - 50 °C полужидким (0,3-процентным) СПА в соответствии с наставлением по применению препаратов. Не допуская застывания, среду разливают по 2,5 мл в стерильные пробирки. Для контроля стерильности пробирки со средой помещают в термостат на 48 часов при 37 °C. Стерильная среда может быть использована для работы (при сохранении ее в холодильнике) в течение месяца. Культуру подвижных штаммов (с верхнего слоя полужидкого агара в пробирке Крейджи) засевают уколом в пробирки с приготовленной средой, инкубируют (20 - 37 °C) в течение 18 - 20 часов. При соответствии H-антигена испытуемого штамма и H-сыворотки бактерии растут вдоль линии укола (положительный результат). При несоответствии H-антигена и H-сыворотки наблюдают рост в виде диффузного помутнения среды в пробирке (отрицательный результат). В случаях определения H-антигена у слабоподвижных штаммов проводят многократное пассирование на полужидком агаре в пробирках Крейджи, после чего определяют H-антиген по указанной методике. Антигенно-диагностическая схема известных ЭПЭ представлена в табл. 22.

Таблица 22

АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА ИЗВЕСТНЫХ

РАЗНОВИДНОСТЕЙ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ЭШЕРИХИЙ

┌───┬──────────────────┬─────────────────────────────────────────┐

│ N │ OK-группа │ H-антигены, определяющие серовары │

│п/п│ │ │

├───┼──────────────────┼─────────────────────────────────────────┤

│1. │018ac:K77 │1, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 16, 26, 30, 32 │

│2. │020:K84 │9, 10, 19, 25, 26, 34 │

│3. │025:K11 │6, 12, 30 │

│4. │026:K60 │2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18 │

│5. │033:K │2, 6, 7, 10, 11, 21, 25 │

│6. │044:K74 │4, 12, 18, 32, 34 │

│7. │055:K59 │1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 19, 21, 25,│

│ │ │27, 32, 33, 34, 39 │

│8. │075:K │ │

│9. │086a:K61 │2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 21, 26, │

│ │ │27, 34, 47 │

│10.│0112ac:K66 │H- <*> │

│11 │0111ab:K58 │2, 4, 6, 7, 11, 12, 16, 20, 21, 25, 27, │

│ │ │30, 32, 34, 40, "635" │

│12.│0114:K90 │4, 10, 21, 32 │

│13.│0119:K69 │1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 18, 25, 27, 32, │

│ │ │39, 40 │

│14.│0124:K72 │2, 12, 16, 19, 30, 32, 38 │

│15.│0125:K70 │2, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 15, 19, 21, 25, │

│ │ │30, 32, 40 │

│16.│0126:K71 │2, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 25, │

│ │ │27, 29, 30, 33, 34, 45 │

│17.│0127:K63 │1, 4, 5, 6, 9, 11, 19, 21, 26, 27, 33, │

│ │ │40, "635" │

│18.│0128abc:K67 <**> │2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 19, 21, │

│ │ │27, 35 │

│19.│0142:K86 │6, 18, 38 │

│20.│0143:K │12 │

│21.│0144:K │4, H- <*> │

│22.│0151:K- │10, 11 │

│23.│"408" │10, 12 │

└───┴──────────────────┴─────────────────────────────────────────┘

--------------------------------

<*> Неподвижные штаммы (H-) могут быть и в других серогруппах и являются самостоятельными сероварами.

<**> Объединены обе разновидности - 0128ab:K67 и 0128ac:K67.

Во всех случаях, включая поиск возбудителей парентеральных эшерихиозов, исследование проводят обычным бактериологическим методом, начиная с определения вида E. coli по биохимическим признакам с последующим серологическим типированием.

Среди культур, выделяемых при этом, могут быть штаммы с K-антигеном типа A, который не разрушатся при кипячении. Поэтому в случае O-инагглютинабельности бактерий после кипячения их следует автоклавировать при 120 °C в течение 2,5 часа, после чего повторно испытывать в реакции агглютинации с O-сыворотками. Серологическое типирование эшерихий, не относящихся к ЭПЭ, проводят по O- и H-антигенам в соответствии со схемой (табл. 23) и при наличии диагностических препаратов.

Таблица 23

АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ПАРЕНТЕРАЛЬНЫХ ЭШЕРИХИОЗОВ

┌────────┬───────────────────────┬────────┬──────────────────────┐

│O-группа│ H-антигены, │O-группа│ H-антигены, │

│ │ определяющие серовары │ │определяющие серовары │

├────────┼───────────────────────┼────────┼──────────────────────┤

│01 │4, 5, 7, 8, 10, 33, 45 │016 │7 │

│02 │1, 4, 5, 49 │016 │18, 32 │

│04 │1, 4, 5, 18, 20, 27, 42│018 │7, 14, 19 │

│05 │4, 8, 10 │020 │4, 9 │

│06 │1 │021 │2, 4, 7, 12, 25 │

│07 │4 │022 │1 │

│08 │1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, │025 │4 │

│ │10, 16, 19, 20, 21, 25,│ │ │

│ │26, 28, 30 │ │ │

│09 │4, 7, 8, 9, 10, 17, 19 │026 │40 │

│010 │4, 12, 14 │076 │5, 7, 10, 16, 19 │

│011 │4, 10, 25 │077 │18, 44 │

│015 │4, 9, 10, 18, 21, 27 │0101 │4, 9 │

└────────┴───────────────────────┴────────┴──────────────────────┘

Примечание: среди возбудителей парентеральных эшерихиозов могут встречаться эшерихии и других O-групп и сероваров.

Штаммы, принадлежащие по биохимическим свойствам к виду E. coli (см. табл. 7), испытывают в реакции агглютинации на стекле. Для этого суточный рост культуры на скошенном СПА смывают 2 мл ИХН. Полученную густую взвесь переносят в пробирки и прогревают на водяной бане при 100 °C в течение 30 минут. Одну каплю гретого диагностикума соединяют с каплей сыворотки на предметном стекле путем многократного покачивания, после чего учитывают результат при помощи лупы или вогнутого зеркала. Реакция может быть замедленной, в связи с чем отрицательный результат наблюдают 3 - 5 минут. В положительном случае образуется мелкозернистый O-агглютинат.

После установления O-антигена у штамма определяют H-антиген в пробирочной реакции агглютинации, для чего можно использовать H-сыворотки, выпускаемые для реакции иммобилизации. Сыворотку с этой целью используют в том же или в 2 раза большем разведении по сравнению с указанными для реакции иммобилизации. Для приготовления H-диагностикума исследуемый штамм пассируют в полужидком 0,3-процентном СПА в пробирках Крейджи по меньшей мере трехкратно. После пассирования штамм засевают в пробирку с бульоном, выращивают до следующего дня в термостате при 25 - 30 °C, при отсутствии этих условий можно выращивать при 37 °C. В бульонную культуру добавляют 0,5% (по объему) формалина и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Реакцию агглютинации ставят в узкой или лучше конусообразной пробирке, содержащей 0,5 мл разведенной сыворотки с добавлением равного объема приготовленного формалинизированного диагностикума. Инкубируют 2 часа при 37 °C и 30 минут при комнатной температуре. Результат учитывают невооруженным глазом, избегая встряхивания пробирки. В случае положительных результатов образуется рыхлый придонный агглютинат, легко разрушающийся при встряхивании. При наличии H-сывороток для реакции агглютинации H-антиген определяют в реакции агглютинации на стекле согласно наставлению по применению препаратов без предварительного многократного пассирования штамма через полужидкий агар.

Род Citrobacter включает два вида: Citrobacter freundii и Citrobacter intermedius. Дифференциация видов возможна при использовании тестов, приведенных в таблице 24.

Таблица 24

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ РОДА CITROBACTER

┌───────────────────┬─────────────┬──────────────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ C. freundii │ C. intermedius │

│ │ ├─────────┬────────────────────┤

│ │ │ вид │биовар diversus <*> │

├───────────────────┼─────────────┼─────────┼────────────────────┤

│Малонат натрия │- │-, + │+ │

│Индол │- │+ │+ │

│Сероводород │+ │- │- │

│Адонит │- │- │+ │

└───────────────────┴─────────────┴─────────┴────────────────────┘

--------------------------------

<*> Даны дифференцирующие тесты для биовара diversus, рассматриваемого в некоторых классификациях как вид.

Для эпидемиологических целей бактериям рода Citrobacter могут быть даны серологические характеристики в соответствии с антигенно-диагностической схемой (см. соответствующий раздел "Методических указаний").

Род Klebsiella. Характерной особенностью представителей рода является их неподвижность, способность образовывать капсулы. Род представлен тремя видами (см. табл. 1), дифференциацию которых осуществляют с помощью тестов, приведенных в табл. 25

Таблица 25

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ РОДА KLEBSIELLA

┌───────────────────┬─────────────┬──────────┬───────────────────┐

│ Тест или субстрат │K. pneumoniae│K. ozaenae│K. rhinoscleromatis│

├───────────────────┼─────────────┼──────────┼───────────────────┤

│Глюкоза (газ) │+ │X │- │

│Лактоза │+ │X │- │

│Дульцит │-, + │- │- │

│Инозит │+ │X │+ │

│Реакция с │-, + │+ │+ │

│метиловым красным │ │ │ │

│Реакция Фогеса - │+, - │- │- │

│Проскауэра │ │ │ │

│Цитрат Симонса │+ │X │- │

│Мочевина (по │(+), + │X │- │

│Кристенсену или │ │ │ │

│по Преусу) │ │ │ │

│Малонат натрия │+ │X │+, - │

│Лизиндекарбоксилаза│+ │X │- │

│Индол │-, + <*> │- │- │

└───────────────────┴─────────────┴──────────┴───────────────────┘

--------------------------------

<*> K. pneumoniae, образующие индол, а иногда и замедленно разжижающие желатин, именуют биоваром oxytoca (по некоторым классификациям этот биовар расценивают как самостоятельный вид K. oxytoca).

Определение K-сероваров - см. соответствующий раздел "Методических указаний".

Род Enterobacter объединяет подвижные, иногда образующие капсулы энтеробактерии, представленные двумя видами: E. cloacae и E. aerogenes. Дифференциации видов проводят с помощью биохимических тестов, приведенных в табл. 26.

Таблица 26

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ ENTEROBACTER

┌─────────────────────────┬───────────────┬──────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ E. cloacae │ E. aerogenes │

├─────────────────────────┼───────────────┼──────────────────────┤

│Малонат натрия │+, - │+ │

│Лизиндекарбоксилаза │- │+ │

│Аргининдигидролаза │+ │- │

│Инозит │- │+ │

│Мочевина │+, - │- │

└─────────────────────────┴───────────────┴──────────────────────┘

Антигенно-диагностическая схема для рода Enterobacter не разработана.

Род Hafnia. Характерным свойством гафний является изменение ферментативной активности при различной температуре культивирования (реакции с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра, газообразование в среде Гисса с глюкозой, утилизация цитрата в среде Симонса).

Род Hafnia представлен одним видом Hafnia alvei, основные биохимические свойства которого с учетом влияния на некоторые из них температурного режима инкубации приведены в табл. 27.

Таблица 27

ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА HAFNIA ALVEI

┌─────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ Биохимические свойства при: │

│ ├────────────────┬─────────────────┤

│ │ 37 °C │ 22 °C │

├─────────────────────────────┼────────────────┴─────────────────┤

│ │┌───────────────────────────────┐ │

│Реакция с метиловым красным ││+ - │ │

│Реакция Фогеса - Проскауэра ││X + │ │

│Цитрат Симонса ││(+), - X │ │

│Глюкоза (газ) ││X + │ │

│ │└───────────────────────────────┘ │

│Лактоза │ -, (+) - │

│Сероводород │ - - │

│Индол │ - - │

│Мочевина │ - - │

│Лизиндекарбоксилаза │ + + │

│Сорбит │ - - │

│Подвижность │ X + │

└─────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘

Примечание. В рамках указаны свойства, изменяющиеся в зависимости от температуры культивирования.

Род Serratia. Представители рода подвижны, иногда образуют капсулу; обращает на себя внимание способность некоторых штаммов образовывать пигмент фуксиново-красного или розового цвета. Род представлен одним видом Serratia marcescens, объединяющим ряд биоваров (табл. 28), расцениваемых в некоторых классификациях как самостоятельные виды (S. liquefaciens, S. rubidaea).

Таблица 28

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БИОВАРОВ ВИДА S. MARCESCENS

┌──────────────────────┬─────────────────────────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ Биовары │

│ ├─────────────┬───────────────┬───────────┤

│ │S. marcescens│S. liquefaciens│S. rubidaea│

├──────────────────────┼─────────────┼───────────────┼───────────┤

│Глюкоза (газ) <*> │X │+ │X │

│Лактоза │- │X │+ │

│Арабиноза │- │+ │+ │

│Сорбит │+ │+ │- │

│Цитрат Симонса │+ │+ │+, - │

│Малонат натрия │- │- │X │

│Лизиндекарбоксилаза │+ │X │X │

│Орнитиндекарбоксилаза │+ │X │- │

└──────────────────────┴─────────────┴───────────────┴───────────┘

--------------------------------

<*> Слабое газообразование.

Род Proteus. В состав рода входят 5 видов (см. табл. 1), из которых по крайней мере двум видам (P. vulgaris и P. mirabilis) свойственна способность к роению (вуалеобразный рост на плотных средах). Идентификацию видов осуществляют с использованием биохимических тестов, приведенных в табл. 29, а определение подгрупп A и B вида Proteus inconstans (Providencia) - в соответствии с табл. 30.

Таблица 29

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ PROTEUS

┌─────────────────────┬───────────┬────────┬───────────┬────────┬─────────┐

│ Тест или субстрат │P. vulgaris│P. mira-│P. morganii│P. rett-│P. incon-│

│ │ │bilis │ │geri │stans │

├─────────────────────┼───────────┼────────┼───────────┼────────┼─────────┤

│Индол │+ │- │+ │+ │+ │

│Сероводород │+ │+ │- │- │- │

│Желатин │+, (+) │+ │- │- │- │

│Цитрат Симонса │+ │+, (+) │- │+ │+ │

│Адонит │- │- │- │+ │-, + │

│Мальтоза │+ │- │- │- │- │

│Инозит │- │- │- │+ │-, + │

│Орнитиндекарбоксилаза│- │+ │+ │- │- │

│Мочевина │+ │+ │+ │+ │- │

└─────────────────────┴───────────┴────────┴───────────┴────────┴─────────┘

Таблица 30

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОДГРУПП ВИДА PROTEUS INCONSTANS

┌─────────────────────┬────────────────────┬─────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ Подгруппа A │ Подгруппа B │

│ │ (Providencia │ (Providencia │

│ │ alcalifaciens) │ stuartii) │

├─────────────────────┼────────────────────┼─────────────────────┤

│Глюкоза (газ) │+, - │- │

│Адонит │+ │- │

│Инозит │- │+ │

└─────────────────────┴────────────────────┴─────────────────────┘

Для серологической идентификации двух видов Proteus (P. vulgaris, P. mirabilis) разработана антигенно-диагностическая схема и выпускаются коммерческие агглютинирующие сыворотки (см. соответствующий раздел "Методических указаний"). Для P. inconstans (Providencia) разработана антигенно-диагностическая схема, но нет выпуска коммерческих сывороток. При отсутствии диагностических агглютинирующих H-сывороток и необходимости установления однородности выделенных штаммов протея по H-антигену используют феномен Дикоса (см. раздел "Определение эпидемиологических маркеров").

Род Edwardsiella представлен одним видом Edwardsiella tarda, биохимические свойства которого приведены в табл. 31.

Таблица 31

ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА EDWARDSIELLA TARDA

┌──────────────────────────────┬─────────────────────────────────┐

│ Тест или субстрат │ Биохимические свойства │

├──────────────────────────────┼─────────────────────────────────┤

│Индол │+ │

│Сероводород │+ │

│Маннит │- │

│Лактоза │- │

│Глюкоза (газ) │+ │

│Лизиндекарбоксилаза │+ │

│Подвижность │+ │

│Мочевина │- │

└──────────────────────────────┴─────────────────────────────────┘

Род Yersinia включает три вида (см. табл. 1), из них Y. pestis подлежит изучению в специальной сети лабораторий. Характерной особенностью Y. enterocolitica и pseudotuberculosis является более низкий оптимум температуры культивирования (22 - 25 °C) и рост на пластинчатых средах в виде мелких колоний-росинок, нередко с выраженным полиформизмом, усугубляющимся при 37 °C и менее выраженным при 22 - 25 °C.

По совокупности биохимических тестов (табл. 32) может быть проведена дифференциация видов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Таблица 32

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ РОДА YERSINIA <*>

--------------------------------

<*> Без вида Y. pestis.

┌─────────────────────────────────┬─────────────────────┬─────────────────┐

│ Тест или субстрат │Y. pseudotuberculosis│Y. enterocolitica│

├─────────────────────────────────┼─────────────────────┼─────────────────┤

│Глюкоза │- │-, + │

│Сахароза │- │+ │

│Мочевина │+ │+, (+) │

│Сероводород │- │- │

│Индол │- │X │

│Ацетат натрия │- │X │

│Сорбит │- │+ │

│Реакция Фогеса - Проскауэра │- │+ │

│(при 22 - 25 °C) │ │ │

│Подвижность │- (37 °C) │- (37 °C) │

│ │+ (22 °C) │+ (22 °C) │

│Целлобиоза │- │+ │

│Рамноза │+ │- │

└─────────────────────────────────┴─────────────────────┴─────────────────┘

Определение серологических характеристик иерсиний в практических лабораториях не проводят в связи с отсутствием производственного выпуска диагностических сывороток.

Дополнительным тестом для идентификации Y. pseudotuberculosis служит достаточно специфичный бактериофаг (<...>), выпускаемый как коммерческий препарат. Большинство свежевыделенных штаммов Y. pseudotuberculosis хорошо лизируется этим бактериофагом; методика постановки пробы обычная, с использованием цельного и разведенного фага.

Род Erwinia по совокупности биохимических и других биологических свойств делят на три группы (см. табл. 1), объединяющие <...> видов. Оптимум роста 27 - 30 °C. Из клинических материалов от человека и животных выделяют Erwinia herbicola. Оптимальной температурой для E. herbicola является 25 - 27 °C. Некоторые представители обладают способностью образовывать желтый пигмент. Биохимические свойства Erwinia herbicola приведены в табл. 33.

Таблица 33

┌─────────────────────────────────────────┬──────────────────────┐

│ Тест или субстрат │Биохимические свойства│

├─────────────────────────────────────────┼──────────────────────┤

│Глюкоза (газ) │- │

│Лактоза │X │

│Сахароза │+ │

│Мочевина │- │

│Индол │- │

│Сероводород │-, + │

│Цитрат Симонса │+ │

│Маннит │+ │

│Инозит │X │

│Адонит │- │

│Сорбит │X │

│Реакция с метиловым красным │- │

│Реакция Фогеса - Проскауэра │X │

│Фенилаланиндезаминаза │X │

│Желатин │+ │

│Малонат натрия │X │

└─────────────────────────────────────────┴──────────────────────┘

2.3.4. Ускоренная идентификация и выявление антигенов

энтеробактерий

Эти методы направлены либо на ускорение этапов обычного бактериологического анализа, либо на индикацию бактерий без выделения чистой культуры возбудителя.

2.3.4.1. Системы индикаторные бумажные (СИБ)

Системы состоят из индикаторных бумажек, представляющих собой пропитанные необходимыми для дифференциации субстратами индикаторные диски или полоски хроматографической бумаги, стабилизированные полимерным покрытием. Системы СИБ выпускают в виде наборов разного назначения: набор N 1 (13 наименований) предназначен для идентификации вибрионов; N 2А - малый набор, включающий 9 наименований, - для межродовой дифференциации энтеробактерий. Он позволяет определять ферментацию лактозы, образование сероводорода и индола, утилизацию цитрата и малоната, гидролиз мочевины, дезаминирование фенилаланина, декарбоксилирование лизина и наличие бета-галактозидазы. Набор N 2Б - расширенный, включающий 25 наименований, предназначен для дальнейшей дифференциации энтеробактерий. В него включены, помимо субстратов, содержащихся в наборе N 2А, оркитин, желатин, реактив для определения цитохромоксидазы и широкий набор углеводов. Набор N 3 предназначен для ускоренного определения обсемененности воды E. coli и состоит из двух компонентов, обеспечивающих определение ферментации глюкозы и цитохромоксидазы.

Работа с СИБ требует наличия чистой 18 - 24-часовой агаровой культуры.

Для определения цитохромоксидазы суточную агаровую культуру растирают петлей на соответствующей индикаторной бумажке, помещенной в чашку Петри. Цитохромоксидазоположительные культуры (не энтеробактерии) вызывают синее окрашивание через 30 - 60 секунд. Цитохромоксидазоотрицательные не изменяют окраски.

Образование индола определяют в пробирках с 0,2 - 0,3 мл ИХН, pH 7,2 - 7,4, куда вносят полную петлю агаровой культуры и затем стерильным пинцетом опускают в пробирку сложенную вдвое "индольную" бумажку так, чтобы короткий конец, имеющий желтоватую окраску, находился над поверхностью суспензии. Пробирки помещают в термостат на 2 часа, однако положительный результат (красно-малиновое окрашивание) зачастую проявляется уже через 30 - 40 минут.

Фенилаланиндезаминазу определяют также в микробной взвеси. В пробирку погружают диск с фенилаланином, выдерживают 1 час при 37 °C и затем погружают в суспензию другой диск с хлоридом железа. При положительном результате через 10 - 15 секунд появляется зеленое окрашивание.

Наличие бета-галактозидазы определяют, помещая в суспензию на 4 - 8 часов (при 37 °C) соответствующий диск. Предварительный учет возможен через 1 час. В случае положительной реакции диск желтеет.

Определение желатиназы проводят также в микробной взвеси, помещая в нее диск засвеченной и проявленной фотопленки, с последующей инкубацией при 37 °C в течение 18 - 24 часов. Предварительный учет возможен через 4 - 5 часов. При положительной реакции фотопленка просветляется, а на дне пробирки выпадает черный осадок.

Образование сероводорода определяют в чашках Петри на СПА или в пробирках с полужидким агаром (0,4 - 0,6%). На поверхностях агара в чашке делают посевы петлей в виде площадок (примерно 0,5 куб. см). В полужидкий агар культуру засевают уколом. Индикаторные бумажки помещают на засеянные площадки или на поверхность полужидкого агара в пробирку. Посевы инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C. Предварительный учет возможен через 5 часов. При положительной реакции диски чернеют. В пробирках можно учитывать также и подвижность бактерий.

При определении отношения к аминокислотам, утилизации цитрата и малоната суточную агаровую культуру суспендируют в 0,2 - 0,3 мл забуференного раствора ИХН с pH 5,4 - 5,6. В суспензии помещают (стерильным пинцетом) соответствующие индикаторные диски и выдерживают при 37 °C 18 - 24 часа. Пробирки с "аминокислотными" дисками до инкубирования заливают стерильным вазелиновым маслом (0,1 - 0,2 мл). При положительном результате в тестах с аминокислотами появляется синее или интенсивно зеленое окрашивание. В тестах с цитратом окрашивание малиново-красное, при этом возможен предварительный учет через 5 часов.

Ферментацию углеводов определяют на СПА в чашках Петри или в пробирках, содержащих 0,2 - 0,3 мл ИХН или 1% пептонной воды. Посевы делают, как уже было сказано ранее. "Углеводные" диски помещают на засеянные площадки агаровой поверхности или в пробирки с микробной взвесью. Для определения газообразования на диск с глюкозой в чашке наносят 4 - 5 капель расплавленного и охлажденного до 45 °C полужидкого (0,6 - 0,8-процентного) агара, а в пробирку с "глюкозным" диском помещают маленький кусочек стерильной ваты. Чашки и пробирки выдерживают в термостате при 37 °C 5 часов. При положительном результате диски на агаровых культурах изменяют первоначальный красный цвет на желтый, в пробирках среда приобретает желтую окраску. В чашках результаты следует учитывать точно через 5 часов (позднее возможна редукция); в пробирках учет результатов возможен и через 18 - 20 часов.

Подробности работы с системами СИБ изложены в наставлениях, прилагаемых к наборам.

В отдельных случаях системы СИБ могут давать нечеткие результаты, что зависит, в основном, от ряда нарушений (работа со смешанными культурами, недостаточная концентрация микробных клеток в суспензии, нарушение режима pH, какие-либо отклонения от правил, изложенных в наставлении) и некоторых других факторов.

2.3.4.2. Метод иммунофлуоресценции

Метод применяют для обнаружения энтеробактерий в испражнениях, рвотных массах и другом материале от больных или из объектов окружающей среды в качестве экспресс-метода индикации.

Для учета реакции используют люминесцентный микроскоп: МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 или МЛД-1 (последний предназначен для работы в полевых условиях), "Люмам" (Р-1, Р-2, Р-3). При люминесцентной микроскопии применяют специальные осветители: ОИ-18, ОИ-17, ОСЛ-1 или ОИ-28 (портативный).

Препараты для исследования готовят путем непосредственного нанесения материала на предметное стекло (в случаях предположения о массивном обсеменении) или с предварительным подращиванием на питательных средах. В первом случае при исследовании жидкого материала делают тонкий мазок, при оформленном стуле или исследовании пищевых продуктов готовят 20-процентную суспензию в ИХН. Для мазка используют верхнюю часть суспензии после ее отстаивания в течение 20 минут или центрифугирования при 1000 об./мин. в течение 5 - 10 минут. При подращивании в соответствующих средах обогащения их выдерживают при 37 °C в течение 18 - 20 часов, на плотных дифференциально-селективных средах - 4 часа, после чего готовят мазки или отпечатки. Лучшие результаты - сочетание исследования прямых мазков и мазков после подращивания. Иммунофлуоресценцию можно использовать при обычном ходе бактериологического анализа, сделав мазки из подозрительных колоний, выросших на плотной среде (Эндо, ЭМС-агар, среда Плоскирева, ВСА).

Для выявления энтеробактерий используют прямой и непрямой люминисцентно-серологический методы.

Прямой метод - мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе и фиксируют 96° этиловым спиртом (можно смесью Никифорова) в течение 15 минут (или путем трехкратного проведения через пламя горелки). Фиксированные препараты немедленно помещают во влажную камеру (чашки Петри, кюветы, эксикаторы с увлажненной ватой или фильтровальной бумагой), наносят на них пастеровской пипеткой каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении на срок, указанный в наставлении по применению люминесцирующей сыворотки. После экспозиции мазки тщательно промывают ИХН или 0,15 М раствором NaCl в течение 10 минут, дважды меняя раствор в стаканчике, или под текущей струей, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. В случае необходимости фиксированные мазки можно хранить несколько дней в минусовом отсеке холодильника.

При необходимости корректирования рабочего разведения заведомо известный штамм подвергают окрашиванию люминесцирующей сывороткой, взятой в нескольких разведениях (выше и ниже указанного на этикетке). Максимальное разведение, которое обеспечивает яркое специфическое свечение микробов в данном микроскопе, оценивают как "красящий титр". В качестве рабочего разведения принимают удвоенный "красящий титр".

Мазки исследуют в темной комнате. При использовании иммерсионной системы применяют специальное нелюминесцирующее масло. Для получения достоверных результатов необходимо просматривать не менее 20 - 25 полей зрения.

Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, имеют яркое зеленоватое свечение периферии клетки, по морфологии соответствующей энтеробактериям. Такое свечение называют специфическим в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки.

Для оценки интенсивности свечения используют систему 4-х плюсов: "++++" - очень яркая флуоресценция на периферии клеток, четко контрастирующая с темным телом бактерий; "+++" - яркая флуоресценция периферии клетки; "++" или "+" - слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Положительными результатами считают реакции на "++++" и "+++" при наличии 2 - 5 специфически светящихся клеток в каждом поле зрения. В отношении антигенно обособленных энтеробактерий, например S. sounei, для положительного ответа достаточно обнаружить в препарате единичные ярко светящиеся палочковидные микробы.

Прямая микроскопия мазка из нативного материала от больных при высокой концентрации возбудителя (500 тысяч - 1 млн. клеток в 1 г) позволяет дать положительный ответ через 45 - 60 минут. При использовании метода накопления и при незначительной концентрации возбудителя (тысячи - десятки тысяч клеток) результаты могут быть получены в период от 5 до 20 часов.

Непрямой метод - на препарат, содержащий антиген, наносят капли диагностической немеченной сыворотки и оставляют при комнатной температуре на 10 - 20 минут (во влажной камере), затем промывают 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2 - 7,4) дважды по 10 минут для удаления несвязавшейся сыворотки. Мазки подсушивают на воздухе и на 10 - 20 минут наносят капли люминесцирующей антивидовой сыворотки против глобулинов того вида животного, от которого получена примененная иммунная сыворотка. Мазки промывают и просматривают, как при прямом методе. Для непрямого метода обязателен контроль: изучаемый антиген, обработанный люминесцирующей сывороткой.

2.4. Формулировка ответов, сроки выдачи

1. В отчете о выделении патогенных энтеробактерий название микроорганизма следует давать в латинской транскрипции, указывая его род, вид, серологическую характеристику; в случаях определения эпидмаркеров эти данные указывают после названных.

Наименование сероваров эшерихий приводят по их антигенным формулам с указанием O-, K-, H-антигенов (для энтеропатогенных разновидностей); O- H-антигенов - для возбудителей парентеральных эшерихиозов.

Например: "Выделены S. flexneri (Shigella flexneri) 4a (биовар 7)"

"Выделены S. typhi (Salmonella typhi)"

"Выделены E. coli (Escherichia coli) 055:K59:H2" или

"Выделены E. coli (Escherichia coli) 01:H4".

2. При выделении УПЭ в отсутствие патогенных энтеробактерий вначале следует указать: "Патогенные энтеробактерии не выделены, выделены _________".

Для УПЭ правила написания рода и вида выделенных бактерий те же, что в пункте 1.

В случаях проведения количественных определений УПЭ после их названия

указывают: "______ 10 КОЕ/г (мл)" <*>.

--------------------------------

<*> КОЕ - колониеобразующая единица.

Если дозированные посевы не применяли (количественные определения не проводили), однако в прямом посеве на пластинчатых средах очевидно преобладание однородных колоний названного вида (при исследованиях материалов, имеющих собственную микрофлору), следует указать: "_______ обильный рост <**> ________" или "________ абсолютное преобладание ________".

--------------------------------

<**> Сплошной рост не поддающихся подсчету колоний установленного вида.

3. Отрицательный ответ при бактериологических исследованиях на выделение патогенных энтеробактерий может быть выдан в следующие сроки: при исследовании крови - на 10-й день исследования после четырех высевов на пластинчатые среды;

при исследовании желчи (дуоденального содержимого) - на 8-й день исследования после 4-х высевов на пластинчатые среды;

при исследовании мочи, испражнений, секционного материала без использования сред обогащения (при отсутствии "подозрительных колоний" на пластинчатых средах первичного посева) - на 2-й день исследования;

то же с использованием сред обогащения (при отсутствии "подозрительных колоний" на пластинчатых средах, засеянных со сред обогащения) - на 3-й день исследования;

при отсутствии в прямых посевах на пластинчатые среды колоний, дающих агглютинацию на стекле с OKA-сывороткой эшерихий, - 2-й день исследования - выдают ответ об отсутствии эшерихий серологических групп, представленных в OKA поливалентной агглютинирующей сыворотке.

При оценке этиологической значимости выделения УПЭ из клинических материалов, обладающих в норме собственной микрофлорой, могут быть использованы следующие данные:

а) количественный показатель - наличие установленных УПЭ при высевах на

-5 -6

пластинчатые среды из 10 - 10 разведения исследуемого материала, т.е.

содержание УПЭ - 10 КОЕ и более на 1 г исследованного субстрата;

б) повторность выделения идентичных микроорганизмов в значительных, особенно нарастающих количествах и исчезновение в период реконвалесценции;

в) ответная реакция макроорганизма - нарастание титра антител к обнаруженным УПЭ при исследовании в динамике ("парных" сывороток) в период до 10 - 14 дней от начала заболевания.

3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ <*>

--------------------------------

<*> Для приготовления питательных сред используют химически чистые реактивы.

3.1. Консерванты

Глицериновый

Состав: Натрий хлорид (NaCl), 0,85-процентный раствор - 1000 мл

Глицерин нейтральный - 500 мл

Натрий гидрофосфат, безводный (Na HPO ),

2 4

20-процентный раствор - 150 мл

Приготовление: смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор гидрофосфата натрия в таком количестве, чтобы довести pH до 7,8 - 8,0, затем разливают в пробирки или флаконы по 10 мл, стерилизуют в автоклаве при 112 °C в течение 15 минут или текучим паром 3 дня подряд. После стерилизации pH 7,6 - 7,8.

Фосфатно-буферный

Состав: Калий дигидрофосфат (KH PO ) - 0,45 г

2 4

Натрий гидрофосфат, безводный (Na HPO ) - 5,34 г

2 4

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 10 мл в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 121 °C 30 минут.

Буферный глицерино-солевой

Состав: Натрий хлорид (NaCl) - 4,2 г

Калий гидрофосфат (K HPO ) - 3,1 г

2 4

Калий дигидрофосфат (KH PO ) - 1,0 г

2 4

Глицерин нейтральный - 300 мл

Вода дистиллированная - 700 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют, перемешивают, смесь разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют при 112 °C 30 минут. Рекомендуется с целью контроля в процессе хранения раствор слабо подкрашивать феноловым красным.

Изотонический раствор хлорида натрия

Состав: Натрий хлорид (NaCl) - 6,5 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: соль растворяют при подогревании, фильтруют, разливают в пробирки по 5 - 7 мл, стерилизуют при 121 °C 30 минут.

3.2. Среды обогащения <*>

--------------------------------

<*> Для получения сред обогащения двойной концентрации (при исследовании жидких материалов) соответственно уменьшают вдвое объем дистиллированной воды.

Селенитовая среда

Состав: Натрий гидроселенит (NaHSeO )

без примеси теллура - 4 г

Пептон венгерский "Рихтер"

или чехословацкий "Спофа" - 5 г

Натрий гидрофосфат, безводный (Na HPO ) - 7 г

2 4

Натрий дигидрофосфат, безводный (NaH PO ) - 2 г

2 4

Лактоза - 4 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: среду готовят из двух основных растворов.

Раствор I. Определяют пропорцию Na HPO и NaH PO используемым образцом

2 4 2 4

пептона и гидроселенита натрия для установления pH в пределах 6,9 - 7,1, с

этой целью регулируют соотношение фосфатов. Подтитровка нужна всегда при

изменении серии любого из входящих в среду основных ингредиентов. После

установления соотношения фосфатов к раствору I добавляют пептон и лактозу.

Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром два дня по 30

минут. Количество фосфатов в рецепте среды дано в расчете на безводные

препараты. При отсутствии таковых заранее заготовленные навески

"выветривают" в термостате в течение 15 - 16 суток.

Раствор II. 10-процентный раствор гидроселенита натрия готовят на стерильной дистиллированной воде перед употреблением. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного раствора (I) добавляют 2 мл раствора гидроселенита натрия (раствора II), асептически разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки и закрывают плотно пробками. Дальнейшая стерилизация не требуется.

Основной раствор (I) для среды можно хранить в холодильнике 1 - 2 месяца. Для приготовления среды следует использовать высококачественный пептон ("Рихтер", "Спофа" или жидкий аминопептид - отечественный заменитель импортного пептона).

Селенитовый бульон с аминопептидом

Состав: Бульон аминопептидный - 950 мл

Натрий гидрофосфат (Na HPO ) - 8 г

2 4

Натрий дигидрофосфат (NaH PO ) - 2 г

2 4

Натрий гидроселенит (NaHSeO ),

10-процентный водный раствор - 40 мл

Приготовление: реакцию среды не устанавливают, т.к. pH колеблется в пределах 7,1 - 7,2. Стерилизуют при 112 °C 20 минут. Непосредственно перед употреблением добавляют 40 мл стерильного 10-процентного водного раствора натрия гидроселенита (pH при этом снижается на 0,1 - 0,2), среду хорошо перемешивают и асептически разливают в стерильные пробирки по 5 мл.

Примечание: фосфаты натрия могут быть заменены калийными в тех же количествах.

Приготовление аминопептидного бульона

Состав: Аминопептид - 250 мл

Натрий хлорид (NaCl) - 5,5 г

Вода дистиллированная - 750 мл

Приготовление: среду хорошо перемешивают, стерилизуют при 121 °C 20 мин. Готовый бульон можно хранить в бутылях неопределенный срок, желательно при 6 - 10 °C.

Магниевая среда

Состав: готовят три раствора.

Раствор I.

Пептон - 4,2 г

Натрий хлорид (NaCl) - 7,15 г

Калий дигидрофосфат (KH PO ) - 1,48 г

2 4

Дрожжевой диализат - 9 мл

Вода дистиллированная - 890 мл

Раствор II.

Магний хлорид (MgCl х 6H O) - 35,7 г

2 2

Вода дистиллированная - 90 мл

Раствор III.

Бриллиантовый зеленый, 0,5-процентный водный раствор - 0,9 мл

Приготовление: все три раствора в указанных количествах смешивают, разливают в необходимых объемах в колбы, флаконы или пробирки, стерилизуют при 112 °C 30 минут.

Среда Мюллера

(тетратионатовый бульон Мюллера)

Состав: Мел, стерилизованный сухим жаром, - 45 г

или

Кальций карбонат (CaCO ), сухой стерильный - 25 г

Бульон Хоттингера, содержащий 120 - 180 мг

аминного азота - 900 мл

Раствор Люголя - 20 мл

Натрий тиосульфат (Na S O х 5H O) <*>,

2 2 3 2

50-процентный стерильный раствор - 100 мл

--------------------------------

<*> Тиосульфат натрия (Na S O х 5H O) часто неправильно именуют

2 2 3 2

гипосульфитом.

Приготовление: в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают по 90 мл бульона Хоттингера. Стерилизуют при 121 °C 30 минут, pH 7,2 - 7,4. Затем ex tempore асептически добавляют в каждый флакон точно по 2 мл раствора Люголя и по 10 мл раствора натрия тиосульфата, хорошо смешивают и разливают по пробиркам. Готовая среда стерилизации не подлежит.

Приготовление растворов: а) раствора Люголя

Калий иодид (KI) - 20 г

Йод кристаллический - 25 г

Вода дистиллированная - 100 мл

б) 50-процентного раствора натрия тиосульфата

В измерительный цилиндр насыпают 50 г натрия тиосульфата и добавляют воду до 100 мл, растворяют, переливают во флакон, стерилизуют текучим паром 30 минут.

Среда Кауфмана

Состав: Среда Мюллера (стерильная) - 500 мл

Желчь бычья (стерильная) - 250 мл

Бриллиантовый зеленый (0,1-процентный

водный раствор) - 50 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, асептически разливают в стерильные пробирки по 10 мл, дополнительно не стерилизуют.

20-процентный желчный бульон

Состав: Бульон мясопептонный или Хоттингера - 800 мл

Желчь бычья нативная - 200 мл

Приготовление: pH должен быть равен 7,6. Разливают в стерильные пробирки или флаконы. Стерилизуют паром 2 дня по 30 минут.

Среда Рапопорт

Состав: Бульон мясопептонный или Хоттингера - 900 мл

Желчь бычья - 100 мл

Глюкоза - 20 г

Индикатор Андреде - 10 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 50 мл во флаконы с поплавками. Стерилизуют текучим паром три дня по 30 минут.

Бульон с 0,2% глюкозы для клебсиелл

Состав: Бульон питательный pH 7,2 - 7,4 (стерильный) - 100 мл

Глюкоза - 2 г

Приготовление: в небольшом количестве теплого бульона растворяют глюкозу, раствор добавляют к остальному бульону, тщательно перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 мл, стерилизуют при 112 °C 30 минут.

Буферная среда обогащения для иерсиний

Состав. Натрий хлорид (NaCl) - 8,5 г

Натрий гидрофосфат (Na HPO х 12H O) 1/15 М раствор - 3 мл

2 4 2

Калий дигидрофосфат (KH PO ) 1/15 М раствор - 7 мл

2 4

Вода дистиллированная - 990 мл

Приготовление: предварительно готовят по 100 мл 1/15 М растворов указанных солей. Затем к ИХН добавляют необходимое количество приготовленных растворов, смешивают, фильтруют, разливают в пробирки по 5 - 6 мл и стерилизуют при 116 °C 10 минут или 30 минут текучим паром, pH среды 7,2.

3.3. Среды для первичных посевов материала

и высевов со сред обогащения

Среды Плоскирева, ЭМС-агар, Эндо, ВСА выпускают в сухом виде. Приготовление сред из сухих препаратов в соответствии с указаниями на этикетках.

Среды с антибиотиками для выделения шигелл

Питательные среды с антибиотиками готовят путем добавления соответствующих препаратов антибиотиков к среде Плоскирева или ЭМС-агару. При выборе антибиотика исходят из результатов определения чувствительности к антибиотикам шигелл, выделяемых в данной местности. Подробности приготовления питательных сред с антибиотиками - см. "Методические рекомендации по применению селективно-дифференциальных сред с антибиотиками для выделения шигелл", МЗ СССР, 1974. Антибиотики могут быть также введены в среду путем диффузии их из вкладываемых под питательную среду в чашке Петри полосок фильтровальной бумаги, пропитанных растворами соответствующих антибиотиков ("метод подосок"). Полоски размером 4 х 0,5 см готовят из фильтровальной бумаги, укладывают "ребром" по 200 штук в чашки Петри и стерилизуют в автоклаве при 121 °C 30 минут, затем подсушивают и пропитывают растворами антибиотиков (левомицетин и тетрациклин в концентрациях 250 мкг/мл, стрептомицин - 500 мкг/мл). Могут быть использованы и другие антибиотики. На смачивание 200 полосок расходуют 12,5 мл раствора антибиотика. Пропитанные раствором антибиотика полоски подсушивают при 37 °C 18 - 20 часов. Готовые полоски хранят в банках с притертыми пробками в холодильнике не более 3-х месяцев.

Среда "Эт-2"

(для выделения эдвардсиелл)

Состав: Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 20 г

Маннит - 10 г

Глюкоза - 2,75 г

L-лизин - 5 г

или

DL-лизин - 10 г

Желчные соли (по Олькеницкому) - 2,5 г

Розоловая кислота (5-процентный спиртовой раствор) - 2 мл

Железо (III) - аммоний цитрат (смесь солей 1:1) - 0,8 г

а) Железо (III) цитрат (FeC H O )

6 5 7

б) Аммоний цитрат /(NH ) C H O /

4 3 6 5 7

Натрий тиосульфат (Na S O х 5H O) - 6,8 г

2 2 3 2

Агар - 25 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: в 20 мл воды растворяют тиосульфат натрия и смесь цитратов в указанных количествах. Все остальные ингредиенты растворяют в воде при подогревании в водяной бане до полного расплавления агара и добавляют приготовленный раствор солей, затем среду фильтруют, устанавливают pH 6,9 - 7,1. Стерилизуют при 112 °C 30 минут, разливают в чашки Петри.

3.4. Среды для первичной идентификации

Агар Клиглера

Коммерческая сухая среда готовится в соответствии с указаниями на этикетке препарата. Готовая к употреблению среда имеет красновато-бурый или оранжево-красный цвет, при скашивании следует оставлять столбик высотой 2 - 2,5 см.

Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому

Состав: Агар питательный сухой - 25 г

Лактоза - 10 г

Сахароза - 10 г

Глюкоза - 1 г

Аммоний-железо (II) сульфат

/(FeSO х (NH ) SO х 6H O/ - 0,2 г

4 4 2 4 2

Натрия тиосульфат (Na S O х 5H O) - 0,3 г

2 2 3 2

Мочевина - 10 г

Феноловый красный (0,4-процентный водный р-р) - 4 мл

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 - 7,4. Добавляют индикатор, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6 - 7 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 минут. Скашивают, оставляя столбик 2 - 2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

3.5. Среды для биохимической дифференциации

Цитратный агар Симонса

Коммерческая сухая среда готовится согласно указаниям на этикетке препарата. Среду разливают по 5 - 7 мл, при скашивании после стерилизации которых оставляют столбик 2 - 2,5 см.

Ацетатный агар

Коммерческая сухая среда, готовят согласно указаниям на этикетке препарата.

Цитратный агар Кристенсена

Коммерческая сухая среда, готовят в соответствии с указаниями на этикетке препарата.

Среда с малонатом

Состав: Дрожжевой экстракт жидкий или - 30 мл

Экстракт сухой - 1 г

Аммоний сульфат (NH ) SO - 0,2 г

4 2 4

Калий дигидрофосфат (KH PO ) - 0,4 г

2 4

Калий гидрофосфат (K HPO ) - 0,6 г

2 4

Натрий хлорид (NaCl) - 2 г

Натрий малонат (CH COOHCOONa) - 3 г

Глюкоза - 0,25 г

Бромтимоловый синий (0,2-процентный водный раствор) - 12 мл

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: в кипящей воде растворяют ингредиенты в указанной последовательности. После добавления каждого реактива среду доводят до кипения, фильтруют, доводят до первоначального объема, охлаждают и устанавливают pH 6,7, добавляют индикатор, разливают в серологические пробирки по 2 мл, стерилизуют при 112 °C 30 минут или при 121 °C 10 минут. Готовая среда имеет бледно-оливковый цвет.

Агар с фенилаланином

Состав: Дрожжевой экстракт жидкий - 100 мл

или экстракт сухой - 3 г

Натрий хлорид (NaCl) - 5 г

Натрий гидрофосфат (Na HPO ) - 1 г

2 4

L-фенилаланин - 1 г

или

DL-фенилаланин - 2 г

Агар - 12 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: дрожжевой экстракт вносят в холодную воду, нагревают ее, затем последовательно добавляют остальные ингредиенты и кипятят до полного расплавления агара (5 - 10 мин.), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают по 2 - 3 мл в агглютинационные пробирки. pH среды должен быть 7,0 - 7,2. Стерилизуют при 112 °C 30 минут и охлаждают в скошенном положении.

Готовая среда не окрашена.

<...> фенилаланина.

Реактив: 10-процентный водный раствор железа (III) хлорида - FeCl .

Хранят при 4 - 6 °C без доступа света.

Среда с мочевиной по Кристенсену

Состав: Пептон - 1 г

Натрий хлорид (NaCl) - 5 г

Калий дигидрофосфат (K HPO ) - 2 г

2 4

Агар - 20 г

Глюкоза - 1 г

Феноловый красный (0,2-процентный раствор) - 6 мл

Мочевина (20-процентный раствор) - 100 мл

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: пептон, соли и агар растворяют при нагревании, устанавливают pH, фильтруют и стерилизуют при 115 °C 20 минут. Затем добавляют глюкозу и индикатор, стерилизуют текучим паром 1 час, охлаждают до 50 - 55 °C. Раствор мочевины после стерилизации фильтрованием через фильтр Зейтца асептически добавляют к основе <*>. Готовую среду асептически разливают в стерильные пробирки и охлаждают в скошенном положении.

--------------------------------

<*> Возможно использование 50-процентного водного раствора мочевины, выдержанного 2 - 3 суток для "самостерилизации", и добавление к среде из расчета конечного содержания мочевины в среде 2%.

Среда с мочевиной по Преусу

Состав: Бульон Хоттингера - 1000 мл

Агар - 15 г

Глюкоза - 5 г

Мочевина (50-процентный водный раствор) - 20 мл

Бромтимоловый синий (0,2-процентный водный раствор) - 12 мл

Приготовление: агар расплавляют в бульоне при подогревании, фильтруют, устанавливают pH 6,9 - 7,0. Стерилизуют при 121 °C 20 минут. К стерильному питательному агару добавляют глюкозу, мочевину, индикатор. Стерилизуют текучим паром однократно 15 минут, после чего скашивают. Цвет готовой среды оливковый.

Среда Кларка

Состав: Пептон - 5 г

Калий гидрофосфат (K HPO ) - 5 г

2 4

Глюкоза - 5 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют в воде, кипятят 2 - 3 мин., фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 6,9 - 7,0, разливают в пробирки. Стерилизуют при 112 °C 20 минут или 3 дня текучим паром по 20 минут.

Среды с углеводами <*>

--------------------------------

<*> Выпускаются коммерческие сухие среды с углеводами (глюкозой, лактозой, мальтозой, сахарозой и маннитом).

Состав: Пептон - 10 г

Натрий хлорид (NaCl) - 5 г

Индикатор Андреде - 10 мл

Углевод - 5 или 10 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Примечание: 1) в качестве индикатора pH могут быть использованы растворы бромтимолового синего, фенолового красного или бромкрезолового пурпурного; 2) для специальных целей среду с лактозой готовят с большим содержанием сахара (2 - 10%); 3) к средам может быть добавлен агар (0,2 - 0,4%).

Приготовление: пептон растворяют в воде при подогревании, добавляют хлорид натрия и индикатор, фильтруют, устанавливают pH 7,1 - 7,2, стерилизуют при 121 °C 15 минут. К стерильной основе добавляют соответствующий углевод. Лактозу, глюкозу, маннит или сахарозу добавляют в количестве 1%, а рамнозу, ксилозу, мальтозу, арабинозу, салицин, трегалозу, рафинозу, целлобиозу, дульцит, сорбит, адонит или глицерин - 0,5%. Среду разливают в стерильные пробирки по 3 - 4 мл, в пробирки с глюкозой помещают поплавки (перевернутые бродильные пробирки Дюрхема). Стерилизуют при 110 °C 30 минут или дробно текучим паром (2 дня подряд по 30 минут).

Среда для определения индолообразования

Возможно использование: а) бульона на триптическом переваре казеина

(1,2 - 1,4% аминного азота);

б) бульона на триптическом переваре Хоттингера

(1,2 - 1,4% аминного азота);

в) 2-процентной пептонной воды;

г) 1-процентной пептонной воды с добавлением

0,3% L-триптофана;

д) полужидкого агара, приготовленного на

бульоне Хоттингера.

Приготовление всех названных сред общеизвестно.

Среды с аминокислотами - лизином, орнитином и аргинином

Состав: Пептон - 5 г

Дрожжевой экстракт - 3 г

или

Аутолизат дрожжей - 12 - 15 мл

Глюкоза - 1 г

Бромкрезоловый - пурпурный (1,6-процентный

спиртовой раствор) - 0,6 мл

Крезоловый красный (0,1-процентный

спиртовой раствор) - 5 мл

L-аминокислота - 10 г

или

DL-аминокислота - 20 г

Указанный в оригинальной прописи индикатор pH может быть заменен на бромтимоловый синий (1 мл 1,6-процентного спиртового раствора).

Вместо дрожжевого экстракта или аутолизата дрожжей можно брать 400 мл мясной воды, соответственно уменьшив объем дистиллированной воды до 600 мл.

Приготовление: в воде растворяют белковую питательную основу и глюкозу. Устанавливают pH 6,0 - 6,1. Затем среду делят на 4 равные части. В каждую из трех порций вносят одну из аминокислот (лизин, орнитин или аргинин) в количестве, зависящем от кристаллизационной формы реактива (L или DL). В последнюю порцию питательной основы аминокислот не добавляют, оставляя ее в качестве контрольной. Среды кипятят 5 - 10 минут и вновь устанавливают pH 6,0 - 6,1. Во все порции вносят раствор индикатора, перемешивают, разливают в агглютинационные пробирки по 2 - 3 мл. Стерилизуют при 110 °C 30 минут.

Среды с органическими кислотами: D-, L- и i-тартрат, мукат

Состав:

Основа. Пептон - 10 г

Натрий гидроокись (NaOH) 0,1 N раствор - 3,5 мл

Бромтимоловый синий (0,2-процентный водный раствор) - 12 мл

Вода дистиллированная - 1000 мл

Органические кислоты.

D-тартрат (правовращающая соль винной кислоты) - 10 г

L-тартрат (левовращающая соль винной кислоты) - 5 г

i (или мезо)-тартрат (оптически

инертная соль винной кислоты) - 5 г

Мукат - 10 г

Приготовление: готовят основу среды, стерилизуют при 120 °C 15 минут, добавляют одну из органических кислот, устанавливают pH 7,4, асептически разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 мл и стерилизуют текучим паром 20 минут.

Готовить среду можно иначе: к указанной основе присоединить одну из органических кислот, установить pH 7,4, разлить в пробирки и стерилизовать при 112 °C 20 минут.

Глицерино-фуксиновый бульон Штерна

Состав: Бульон Хоттингера стерильный, pH 8,0 - 1000 мл

Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор

(10-процентный) - 2,5 мл

Натрий сульфит (Na SO )

2 3

(10-процентный водный раствор) - 16,6 мл

Глицерин нейтральный - 10 мл

Приготовление: к бульону добавляют спиртовой раствор фуксина, свежеприготовленный 10-процентный водный раствор сульфита натрия и глицерин, хорошо смешивают, разливают в пробирки по 6 - 7 мл, стерилизуют при 112 °C 15 минут. Хранить среду можно в холодильнике не более 14 дней.

Среда Ворфаля - Фергюсона

Состав: Натрий хлорид (NaCl) - 2 г

Калий сульфат (K SO ) - 1 г

2 4

Магний сульфат (MgSO х 7H O) - 0,25 г

4 2

Сахароза - 20 г

Дрожжевой экстракт сухой - 2 г

или

Дрожжевой экстракт жидкий - 88 мл

Агар - 15 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Примечание: возможно применение жидкой среды (без добавления агара) согласно оригинальной прописи.

Приготовление: агар расплавляют в теплой воде, добавляют остальные ингредиенты, растворенные в малых количествах воды, хорошо перемешивают, фильтруют, pH не устанавливают, разливают в колбы или флаконы, стерилизуют при 121 °C 15 минут. Перед употреблением разливают в чашки Петри.

3.6. Полужидкий агар для определения подвижности

Состав: Натрий хлорид (NaCl) - 5 г

Гидролизат Хоттингера - 120 - 150 мл

Агар - 3 - 4 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: гидролизат Хоттингера разводят водой до содержания в среде 1,2 - 1,4% аминного азота, добавляют хлорид натрия, устанавливают pH 7,2 - 7,4, добавляют агар и полностью расплавляют его, подогревая среду при постоянном помешивании. Затем фильтруют в горячем состоянии через тканевый фильтр, проверяют прозрачность (визуально) и в случае необходимости осветляют с помощью яичного белка или путем отстаивания в узких сосудах. Среду разливают по 5 мл в пробирки при 121 °C 30 минут. Охлаждают в вертикальном положении.

Примечание: среда может быть одновременно использована для определения индолообразования.

3.7. Среды и реактивы для дифференциации энтеробактерий

от представителей других семейств

Среда для теста на окисление - ферментацию (OF-тест)

Состав: Пептон - 2 г

Натрий хлорид (NaCl) - 5 г

Калий гидрофосфат (K HPO ) - 0,3 г

2 4

Агар - 3 г

Бромтимоловый синий (1-процентный водный раствор) - 3 мл

Глюкоза - 10 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: среда требует особо тщательного приготовления и использования проверенных ингредиентов. Все вещества, входящие в состав среды, растворяют при подогревании в водяной бане, фильтруют, разливают в пробирки по 5 - 6 мл и стерилизуют при 118 °C 10 минут. Готовая среда имеет pH 7,1 - 7,2.

Другой способ приготовления: основу (все компоненты, кроме глюкозы) готовят, как указано выше, затем разливают в пробирки мерно по 5 мл и стерилизуют при 121 °C в течение 15 минут. Глюкозу в виде 10-процентного водного раствора подвергают стерилизующей фильтрации (через фильтры Зейтца или др.) и добавляют асептически по 0,5 мл в каждую пробирку со стерильной основой, используют после тщательного перемешивания. Допустимо хранение при 4 °C 2 - 3 дня.

Среда с KNO для определения редукции нитратов

а) Оригинальная пропись:

Состав: Калий нитрат (KNO ) - 0,2 г

Пептон - 5 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют, смешивают, устанавливают pH 7,4,

разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 121 °C 15 минут.

б) Модификация:

Состав: Калий нитрат (KNO ) - 0,1 г

Пептонная вода (0,5-процентная) - 1000 мл

Натрий хлорид (NaCl) - 2,5 г

Приготовление: 1-процентную пептонную воду разводят вдвое

дистиллированной водой, прибавляют хлорид натрия, вносят нитрат калия, все

ингредиенты растворяют и хорошо перемешивают, фильтруют через бумажный

фильтр, устанавливают pH 7,1 - 7,2, разливают в пробирки по 5 мл и

стерилизуют при 112 °C 30 минут.

Примечание: нитрат калия (KNO ) должен быть свободен от нитритов

(KNO ).

Реактив для реакции с метиловым красным

Состав: Метиловый красный - 0,1 г

Спирт этиловый 96° - 300 мл

Вода дистиллированная - 200 мл

Приготовление: краску растворяют в спирте, затем добавляют воду до 500 мл.

Реактивы для реакции Фогеса - Проскауэра

1. 6-процентный раствор альфа-нафтола

Состав: альфа-нафтол - 30 г

Спирт этиловый 96° - 500 мл

2. 40-процентный раствор KOH

Состав: Гидроокись калия (KOH) - 120 г

Вода дистиллированная - 300 мл

Реактив Эрлиха на индол

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 1 г

Спирт этиловый 96° - 95 мл

Кислота хлористоводородная (HCl) концентрированная - 20 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте и добавить кислоту. Хранить в темном месте.

Реактив Ковача на индол

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 5 г

Спирт амиловый - 75 мл

Хлористоводородная кислота (HCl), концентрированная - 25 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте при нагревании (в водяной бане при 50 - 55 °C). Остудить и добавить кислоту. Реактив должен быть желтого цвета. Хранить при 4 °C.

Индикаторные бумажки для определения индола <*>

--------------------------------

<*> Индикаторные бумажки можно приготовить, используя реактив Ковача или Эрлиха.

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 5 г

Ортофосфорная кислота (H PO ), очищенная,

3 4

концентрированная - 10 мл

Спирт метиловый - 50 мл

Вместо метилового можно использовать этиловый спирт 96° в том же количестве.

Приготовление: в тепловатом растворе ингредиентов смачивают фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре и нарезают полосками (0,5 х 6 см). Цвет бумажек желтый. Хранить в банке темного стекла.

Реактив для определения редукции нитратов

Раствор А. Состав: Сульфониловая кислота - 8 г

Уксусная кислота (5 N раствор) - 1000 мл

Раствор Б. Состав: альфа-нафтиламин - 5 г

или

Диметил-альфа-нафтиламин - 6 г

Уксусная кислота (5 N раствор) - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют при слабом нагревании. Реактивы токсичны, требуют соответствующего обращения. Хранить их необходимо в склянках темного стекла с притертыми пробками при 4 °C. Срок годности реагентов 2 - 3 месяца (при периодическом контроле на известных тест-штаммах).

Реактивы для определения цитохромоксидазы

Раствор А. Состав: Спирт этиловый 95° - 100 мл

альфа-нафтол - 1 г

Диметил-пара-фенилендиамин гидрохлорид - 1 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Примечание: раствор А можно хранить в холодильнике до 10 дней, а раствор Б - только один день.

Реактивы для окраски бактерий по Граму

Реактив I (для первичной окраски)

Состав: Генцианвиолет или кристаллвиолет - 1 г

Спирт этиловый 96° - 10 мл

Фенол - 2 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Приготовление: в ступке растворяют краситель с фенолом, постепенно добавляя спирт и воду, сливают во флакон, выдерживают сутки и затем фильтруют через бумажный фильтр.

Реактив 2. Раствор Люголя (в модификации Грама)

Состав: Калий йодид (KI) - 2 г

Йод кристаллический - 1 г

Вода дистиллированная - 300 мл

Приготовление: йод и йодид калия растворяют в 10 мл воды, оставляют на сутки в мерной колбе, после чего добавляют воду до 300 мл.

Реактив 3. Спирт этиловый 96°

Реактив 4. Фуксин карболовый, разведенный

Состав: а) Фуксин основной - 10 г

Спирт этиловый 96° - 100 мл

Ингредиенты смешивают и ставят в хорошо закрытом флаконе в термостат на

18 - 20 часов.

б) Фенол - 5 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Приготовление: 10 мл спиртового раствора основного фуксина (а) добавляют к 100 мл 5-процентного водного раствора фенола (б), получается крепкий карболовый фуксин, который для работы разводят дистиллированной водой 1:10.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Для усовершенствования методов эпидемиологического обследования и анализа при инфекциях, вызываемых энтеробактериями, характеризующихся большой сложностью и многообразием форм проявления эпидемического процесса, особое значение имеет внутривидовая (внутрисероваровая) дифференциация возбудителей - их эпидемиологическое маркирование.

В основу дифференциации (определения эпидмаркеров) могут быть положены различные свойства микроорганизмов, характеризующиеся стабильностью: биохимические свойства (биовары), антигенная структура (серовары), чувствительность к бактериофагам (фаговары), колициногенная активность (колициногеновары) или чувствительность к колицинам (колициновары), присутствие в штаммах факторов устойчивости к химиотерапевтическим препаратам (R-плазмид определенного типа) и др. У отдельных возбудителей возможно определение ряда эпидмаркеров.

4.1. Определение сероваров у некоторых условно-патогенных

энтеробактерий

Определение сероваров цитробактеров

Определение сероваров возможно у C. freundii при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (таб. 34).

Таблица 34

АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

РОДА CITROBACTER

┌──────┬────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│O- │ O-антигенный │ H-антиген │

│группа│ комплекс │ │

├──────┼────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

│01 │1a, 1b, 1c, 1 │1, 2; 14, 15, 16; 21, 25, 26; 21, 25, 27; 39 │

│02 │2b, 1b │1, 2, 4, 5, 6; 7, 8, 10; 8, 10, 11; 14, 15, 16; │

│ │ │13, 17; 21, 22; 23, 28; 32, 34; 35, 37; 39 │

│03 │3a, 3b и 1c │4, 5; 5, 6; 7, 8, 10; 8; 8, 9; 9, 13, 14; 14, │

│ │ │15, 16; 13, 17; 21, 22; 21, 23; 21, 24; 21, 25; │

│ │ │27, 9, 29, 30; 9, 29, 31; 32, 33; 32, 34; 39; │

│ │ │47; 90 │

│04 │4a, 4b │4, 5; 5, 6; 7, 8, 10; 9, 13, 14; 13, 18, 19; 19, │

│ │ │20; 9, 29, 30; 9, 29, 31; 32, 34; 44, 45; 44, │

│ │ │46; 95 │

│05 │5a, 5b, 4b │53, 54; 63, 73; - │

│06 │6, 4b, 5b │72; 54 │

│07 │7, 3b, 1c, │4, 5; 7, 8, 10; 8, 9; 9, 13, 14; 21, 22; 21, 23; │

│ │ │21, 25, 27; 32, 33, 39; 68 │

│ │8a, 1 │1, 2; 5, 6; 8, 12; 9, 13, 14; 9, 13, 15; 21, 22; │

│ │ │21, 25, 27; 9, 29, 30; 32, 33; 39, 53, 55; 67 │

│08 │8a, 8b │1, 2; 8, 12; 9, 13, 14; 21, 25, 26; 21, 25, 27; │

│ │ │35; 37 │

│ │8a, 8c │5, 6; 9, 13, 14; 13, 17; 21, 25, 27; 32, 33; 35, │

│ │ │37; 76 │

│09 │9a, 9b │1, 2; 2, 3; 4, 5; 8, 9; 13, 17; 21, 25, 26; 32, │

│ │ │33; 32, 34; 39, 48 │

│010 │10, 9b │13, 17; 9, 29, 30; 48; - │

│011 │11 │9, 13, 14; 14, 15, 16; 32, 33; 35, 37; 35, 36; │

│ │ │38; 77, 78; 83 │

│012 │12a, 12b │5, 6; 13, 17; 35, 36; 57; 9, 29, 31; │

│ │12a, 12c │62, 57 │

│013 │13 │5, 6; 59; 65; 66; 69 │

│014 │14 │40, 41; 61 │

│015 │15 │13, 18, 19; 21, 22; 32, 34 │

│016 │16 │21, 24; 58 │

│017 │17 │21, 24; 44, 45; 75 │

│018 │18 │56 │

│019 │19 │14, 15, 16; 87; 74 │

│020 │20 │40, 41, 3 │

│021 │21a, 21b │60; 9, 29, 31; 40, 41; 44, 45; 53, 54; 21, 24 │

│022 │22 │64 │

│023 │23 │52; 41, 97 │

│024 │24 │49, 51; 85 │

│025 │25 │35, 36, 38 │

│026 │26 │49, 50; 59 │

│027 │27 │40, 41 │

│028 │28, 1c │70 │

│029 │29 │8, 10, 11; 40, 42; 74; 75; 77, 78; 77, 79; 77, │

│ │ │80; 77, 88; 82; 83; 84; 85; 96; 87; - │

│030 │30, 21b │76; 35, 37; 89 │

│031 │31 │71 │

│032 │32 │23, 28 │

│033 │33 │87 │

│034 │34 │68 │

│035 │35 │91 │

│036 │36 │35, 36; 54, 78 │

│037 │37 │1, 5 <*> │

│038 │38 │92 │

│039 │39 │61; 94 │

│040 │40 │76 │

│041 │41 │98 │

│042 │42 │68; 98 │

└──────┴────────────────┴─────────────────────────────────────────────────┘

--------------------------------

<*> H-антиген, идентичный H-1,5 сальмонелл.

Первоначально культуру испытывают поливалентными O-сыворотками: CiOA, CiOB, CiOC, CiOD, CiOG, каждая из которых включает антитела к ряду O-групп. Например, CiOA содержит антитела к группам 01, 02, 03, 04, 05, 06, 08; CiOB - 09, 010, 011, 012, 013, 014 и т.д. (см. "Наставление по применению O-сывороток для идентификации бактерий Цитробактер").

При работе с поливалентными сыворотками целесообразно начинать с сывороток CiOA, CiOB, CiOF в связи с большей частотой распространения в стране представителей соответствующих серогрупп. При положительном результате реакции агглютинации с одной из поливалентных сывороток продолжают серологическую идентификацию культур с сыворотками к O-антигенам, входящим в состав поливалентной смеси. При наличии положительной реакции агглютинации с одной из указанных сывороток устанавливают серологическую O-группу штамма. При агглютинации культуры одновременно с двумя или тремя поливалентными O-сыворотками, содержащими общие антитела, культуру дополнительно испытывают с соответствующими факторными сыворотками и на основании полученных данных определяют антигенное строение штамма. После установления O-группы определяют H-антиген с использованием поливалентных и моновалентных H-сывороток. Для определения O- и H-антигена в реакции агглютинации на стекле используют 18 - 20-часовую культуру, на СПА проводят реакцию общепринятым способом.

Определение сероваров протеев

Определение сероваров возможно P. vulgaris и P. mirabilis при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (табл. 35) и "Наставлением по применению агглютинирующих диагностических протейных O- и H-сывороток". Для реакции агглютинации применяют суточную культуру на СПА, которую испытывают вначале с поливалентными, а затем при положительной реакции агглютинации с моновалентными O-сыворотками, входящими в поливалентную. После установления O-группы определяют H-антиген, применяя вначале поливалентные, а затем моновалентные H-сыворотки.

Таблица 35

СОКРАЩЕННАЯ АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА

P. VULGARIS И P. MIRABILIS

┌────────────┬─────────────────┬───────────────┬─────────────────┐

│ O-антиген │ H-антиген │ O-антиген │ H-антитен │

│ (O-группа) │ │ (O-группа) │ │

├────────────┼─────────────────┼───────────────┼─────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │

├────────────┼─────────────────┼───────────────┼─────────────────┤

│1 │1 │26 │2; 3; 6 │

│2 │1 │27 │2; 3 │

│3 │1; 2 │28 │1; 3 │

│4 │1; 8; 16 │29 │13 │

│5 │1; 3 │30 │1; 2; 4; 13; 15 │

│6 │1; 2; 3 │31 │1; 2 │

│7 │1; 3; 4 │32 │1; 3; 5 │

│8 │1 │33 │3 │

│9 │1; 2 │34 │6 │

│10 │1; 2; 3; 4; 5 │35 │2 │

│11 │1; 2; 3; 6 │36 │3; 7 │

│12 │1; 2 │37 │17 │

│13 │1; 2; 3; 4 │38 │1; 2 │

│14 │1; 3 │39 │18 │

│15 │1; 7 │40 │4 │

│16 │1; 9; 14 │41 │1; 2 │

│17 │1; 10 │42 │1 │

│18 │1 │43 │2 │

│19 │1; 3; 11 │44 │11; 19 │

│20 │1; 2 │45 │11 │

│21 │1 │46 │17 │

│22 │1 │47 │1 │

│23 │1; 2; 3; 12 │48 │1 │

│24 │1; 3; 4; 13 │49 │2 │

│25 │1 │ │ │

└────────────┴─────────────────┴───────────────┴─────────────────┘

При отсутствии диагностических H-сывороток и необходимости выяснения однородности выделенных штаммов протея по H-антигену (при выявлении источника инфекции и др.) используют феномен Динеса.

Для выявления феномена Динеса хорошо подсушенную чашку с 2-процентным СПА делят пополам, на каждую половину среды (на полюсах диаметра чашки) засевают по одной капле 4 - 5-часовой бульонной культуры. Чашки с посевами помещают при 37 °C на 18 - 20 часов или оставляют на тот же срок при комнатной температуре, после чего учитывают результаты. При наличии двух идентичных по H-антигену штаммов отмечают слияние зон роста в результате роения. При различных H-антигенах между обоими участками образуется разграничительная (демаркационная) зона шириной в 0,5 - 2 мм.

Разработана антигенно-диагностическая схема P. inconstans (Providencia), но производственный выпуск агглютинирующих сывороток отсутствует.

Определение сероваров у клебсиелл (K. pneumoniae) <*>

--------------------------------

<*> Выпуск коммерческих K-сывороток предполагается в ближайшее время.

Установление сероваров клебсиелл проводят путем определения капсульного (K) антигена в реакции агглютинации на стекле при помощи капсульных K-сывороток. Для получения культуры в капсульной форме исследуемый штамм пассируют через углеводосодержащие среды (0,2-процентный глюкозный бульон и агаровая среда Ворфеля - Фергюсона). Культуру засевают в 0,2-процентный глюкозный бульон и инкубируют в течение 4 час. при 37 °C, после чего пересевают на среду Ворфеля - Фергюсона и инкубируют при той же температуре 18 - 20 часов.

Для реакции агглютинации петлю агаровой культуры со среды Ворфеля - Фергюсона растирают на предметном стекле рядом с каплей соответствующей капсульной клебсиеллезной сыворотки, после чего их тщательно смешивают. Капсульная агглютинация наступает обычно очень быстро и имеет вид крупных хлопьев, тяжей или с трудом разделяемого диска. В сомнительных случаях реакция может наблюдаться в нескольких сыворотках при нахождении культуры в OK- или BK-формах, результат подтверждают в развернутой (пробирочной) реакции агглютинации в разведениях сыворотки 1:2, 1:4. <*>

--------------------------------

<*> Проведение реакции агглютинации и отбор культур в К-форме осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению клебсиеллезных диагностических агглютинирующих сывороток".

Положительный результат этой реакции оценивают по появлению дискообразного плотного агглютината, всплывающего в виде "зонтика" при встряхивании пробирки, разбиваемого с трудом на крупные хлопья.

Определение серогрупп иерсиний

Определение серогрупп проводят в реакции агглютинации на стекле или в пробирках с кроличьими сыворотками с высокими титрами антител против соответствующих сероваров. Вид Y. pseudotuberculosis включает шесть O-групп, но наиболее часто регистрируемыми являются I и затем III и IV O-серогруппы. В связи с этим используют в первую очередь сыворотку против серогруппы O-I. В случае отрицательного результата используют сыворотки против O-серогрупп III и IV и затем II, V и VI серогрупп этих микробов.

Серологическую идентификацию Y. enterocolitica так же, как и псевдотуберкулезного микроба, начинают с использования сыворотки против наиболее распространенных серогрупп 03 и 09, затем 05.27, 08, 06 и других, которые могут встретиться у человека (табл. 36).

Таблица 36

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ИЕРСИНИЙ

┌─────────────────────┬───────────────────────────────────────────┬───────┐

│ Вид иерсиний │ Серогруппы │Биовары│

│ ├───────────────────────────┬───────────────┤ │

│ │ Регистрируемые при │ Не │ │

│ │ заболевании человека │регистрируемые │ │

│ ├─────────┬─────┬───────────┤ │ │

│ │постоянно│редко│в единичных│ │ │

│ │ │ │ случаях │ │ │

├─────────────────────┼─────────┼─────┼───────────┼───────────────┼───────┤

│T. enterocolitica │08 │06.30│010, 013.7,│04.32; 06.31; │1 │

│ │ │ │014 │07.8; 015; 018;│ │

│ │ │ │ │19.8; 020; 021;│ │

│ │ │ │ │022 │ │

│ │09 │- │- │- │2 │

│ │05.27 │- │- │05 │3 │

│ │03 │- │- │- │4 │

│ │- │- │- │- │5 │

│Y. pseudotubercolosis│I │III │IV, II │V, VI │нет │

└─────────────────────┴─────────┴─────┴───────────┴───────────────┴───────┘

Из табл. 36 видно, что по принадлежности к тому или иному биовару (см. последнюю графу табл. 36) возможно предположить принадлежность штамма к той или иной O-серогруппе. Все штаммы Y. enterocolitica серогруппы 03 относятся к 4 биовару, 08 и 06 - к 1-му и 09 - ко 2-му, штаммы серогруппы 05.27 относятся к 3 биовару.

4.2. Определение биоваров

Определение биоваров шигелл

Антигенная однородность S. sonnei и S. flexneri 6 исключает их серологическую дифференциацию, поэтому дальнейшее их разделение на биовары осуществляют при использовании жидких сред с углеводами.

Неодинаковая биохимическая активность по отношению к отдельным углеводам некоторых сероваров шигелл других видов также может быть использована для дифференциации их на биовары.

Определение биоваров S. sonnei

Дифференциация S. sonnei основана на их неодинаковой биохимической активности в отношении рамнозы, ксилозы и мальтозы, что позволяет подразделять их на 7 стабильных биоваров (табл. 37). <*>

--------------------------------

<*> Определение биоваров проводят в соответствии с "Методическими материалами по биохимическому типированию шигелл Зонне" (МЗ СССР, 1971).

Таблица 37

БИОВАРЫ S. SONNEI

┌───────────┬─────────────┬─────────────────┬────────────────────┐

│ Биовар │ Рамноза │ Ксилоза │ Мальтоза │

├───────────┼─────────────┼─────────────────┼────────────────────┤

│Ia │+ (1) │- │+ (1 - 2) │

│IIb │+ (1) │- │+ (> 2) │

│IIg │+ (> 1) │- │+ (1 - 2) │

│IIe │+ (> 1) │- │+ (> 2) │

│IIId │+ (1) │+ (1) │+ (1 - 2) │

│IIIc │+ (1) │+ (1) │+ (> 2) │

│IVf │+ (1) │+ (2 и позже) │+ (1 и позже) │

└───────────┴─────────────┴─────────────────┴────────────────────┘

Обозначения: в скобках указаны сроки ферментации (сутки), "+" - ферментация, "-" - отсутствие ферментации.

Определение биоваров S. flexneri 6

Для определения биоваров у S. flexneri 6 (S. newcastle) используют неодинаковую ферментацию ими глюкозы, маннита и дульцита, что позволяет выявить среди них 3 различных биовара (табл. 38).

Таблица 38

БИОВАРЫ S. FLEXNERI 6 (S. NEWCASTLE)

┌────────────────┬───────────────────────────────────────────────┐

│ Биовар │ Ферментация углеводов │

│ ├───────────────┬───────────────┬───────────────┤

│ │ глюкоза │ маннит │ дульцит │

├────────────────┼───────────────┼───────────────┼───────────────┤

│Boyd 88 │+ │+ │- │

│ │+ │+ │(+) │

├────────────────┼───────────────┼───────────────┼───────────────┤

│Manchester │++ │++ │(++) │

│ │++ │++ │- │

│ │++ │- │(++) │

├────────────────┼───────────────┼───────────────┼───────────────┤

│Newcastle │+ │- │- │

│ │+ │- │(+) │

└────────────────┴───────────────┴───────────────┴───────────────┘

Обозначения (здесь и в последующих таблицах):

"+" - ферментация с образованием кислоты;

"++" - ферментация с образованием кислоты и газа;

"-" - отсутствие ферментации;

"(+)" - замедленная ферментация.

Определение биоваров S. flexneri 1 - 5, X- и Y-variant

В зависимости от биохимической активности по отношению к мальтозе, арабинозе, сорбиту и рамнозе S. flexneri 1 - 5, X- и Y-var. можно подразделить на 15 биоваров, характеристика которых представлена в таб. 39.

Таблица 39

БИОВАРЫ S. FLEXNERI 1 - 5, X- И Y-VARIANTS

┌──────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│ Биовар │ Ферментация углеводов │

│ ├───────────┬───────────┬────────────┬────────────┤

│ │ мальтоза │ арабиноза │ сорбит │ рамноза │

├──────────────┼───────────┼───────────┼────────────┼────────────┤

│1 │+, (+) │+, (+) │+, (+) │+, (+) │

│2 │+, (+) │+, (+) │+, (+) │- │

│3 │+, (+) │- │+, (+) │+, (+) │

│4 │+, (+) │- │- │- │

│5 │+, (+) │- │+, (+) │- │

│6 │+, (+) │+, (+) │- │- │

│7 │+, (+) │+, (+) │- │+ │

│8 │- │+, (+) │+, (+) │+, (+) │

│9 │- │- │+, (+) │+, (+) │

│10 │- │+, (+) │+, (+) │- │

│11 │- │- │+, (+) │- │

│12 │- │+, (+) │- │- │

│13 │- │+ │- │(+) │

│14 │- │- │- │(+) │

│15 │- │- │- │- │

└──────────────┴───────────┴───────────┴────────────┴────────────┘

Определение биоваров S. boydii

Установление биоваров S. boydii, так же как и других шигелл, основано на неодинаковой активности их в отношении отдельных углеводов (сорбит, глицерин, ксилоза, дульцит), что позволяет дифференцировать их на 8 биоваров (табл. 40).

Таблица 40

БИОВАРЫ S. BOYDII

┌────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│ Биовар │ Ферментация углеводов │

│ ├────────────┬────────────┬────────────┬────────────┤

│ │ сорбит │ глицерин │ ксилоза │ дульцит │

├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┤

│1 │+ │+ │+ │+ │

│2 │+ │+ │- │+ │

│3 │+ │+ │+ │- │

│4 │- │+ │- │- │

│5 │+ │+ │- │- │

│6 │- │+ │- │+ │

│7 │+ │- │- │+ │

│8 │- │+ │+ │+ │

└────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴────────────┘

Определение биоваров сальмонелл

В пределах некоторых сероваров сальмонелл наблюдается различная ферментативная активность в отношении отдельных углеводов. Для S. typhimurium, наиболее широко распространенного серовара, установлены четкие биовары (табл. 41).

Таблица 41

БИОВАРЫ S. TYPHIMURIUM

┌──────┬─────────┬───────┬──────┬─────────┬─────────┬─────┬──────┐

│Биовар│Арабиноза│Ксилоза│Рамно-│D-Тартрат│i-Тартрат│Мукат│Инозит│

│ │ │ │за │ │ │ │ │

├──────┼─────────┼───────┼──────┼─────────┼─────────┼─────┼──────┤

│1 │+ │- │- │- │- │- │- │

│2 │+ │+ │- │- │- │- │- │

│3 │+ │+ │+ │- │- │- │- │

│4 │+ │+ │+ │+ │- │- │- │

│5 │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │

│6 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │

│7 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│8 │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │

│9 │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │

│10 │+ │+ │- │+ │+ │- │+ │

│11 │- │+ │- │- │- │+ │+ │

│12 │+ │+ │- │+ │+ │+ │- │

│13 │- │- │- │+ │+ │+ │+ │

│14 │- │- │+ │+ │+ │+ │+ │

│15 │+ │- │+ │+ │+ │+ │- │

│16 │+ │- │+ │- │- │+ │+ │

│17 │+ │+ │+ │- │- │+ │- │

│18 │+ │+ │+ │- │- │+ │+ │

│19 │+ │+ │+ │- │- │- │+ │

│20 │+ │+ │+ │- │+ │- │- │

│21 │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │

│22 │+ │+ │+ │- │+ │+ │- │

│23 │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │

│24 │+ │+ │+ │+ │- │+ │- │

│25 │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │

└──────┴─────────┴───────┴──────┴─────────┴─────────┴─────┴──────┘

В среды с мукатом и тартратами посев проводят петлей, используя 18 - 20-часовую бульонную или агаровую культуру. В тесте с мукатом результаты учитывают через 2 - 4 суток по изменению цвета среды. Положительный результат - изменение первоначального цвета среды (синий с зеленоватым оттенком) на зеленовато-желтый.

В тесте с тартратами результат учитывают через 2 - 4 суток по величине выпавшего осадка через 30 минут после добавления 0,5 мл насыщенного водного раствора уксусно-кислого свинца (объем среды в пробирке должен быть 3 - 4 мл). Величина осадка при положительном результате незначительная и не превышает 1/4 объема среды. При отрицательном результате осадок обычно занимает 1/2 или более объема среды. Для обеспечения возможности учета результатов реакции в разные сроки (через 48, 72 и 96 часов) культуру засевают в несколько пробирок.

Посев в остальные среды и учет результатов проводят по обычной методике.

Принимая во внимание, что многие другие серовары сальмонелл характеризуются вариабельностью биохимической активности по отношению к отдельным углеводам (арабиноза, дульцит, инозит, рамноза, ксилоза), при необходимости они также могут быть подразделены на ряд биоваров.

Определение биоваров у некоторых сероваров E. coli

Биохимические реакции E. coli в отношении отдельных субстратов вариабельны и могут быть использованы для определения биоваров у ряда сероваров (табл. 42, 43, 44).

Таблица 42

БИОВАРЫ E. COLI 0151:K

┌────────────┬───────┬───────┬──────┬─────────┬───────────┬──────┐

│ Серовар │Глюкоза│Дульцит│Сорбит│Арабиноза│Лизиндекар-│Биовар│

│ │ │ │ │ │боксилаза │ │

│ │ │ │ │ │ │ │

├────────────┼───────┼───────┼──────┼─────────┼───────────┼──────┤

│ │ │ │ 1-2 │ │ │ │

│0151:K-:H10 │++ │+ │+ │+ │+ │+ │

│ │ │ │ 1-2 │ │ │ │

│0151:K-:H10 │+ │+ │+ │- │+ │2 │

│0151:K-:H10 │+ │+ │- │- │- │3 │

│ │ │ │ 1-2 │ │ │ │

│0151:K-:H10 │+ │+ │+ │+ │+ │4 │

│ │ │ │ │ │ 2-3 │ │

│0151:K-:H11 │+ │- │(+) │+ │(+) │5 │

└────────────┴───────┴───────┴──────┴─────────┴───────────┴──────┘

Примечание. Цифры указывают сутки появления положительной реакции.

Таблица 43

БИОВАРЫ E. COLI 0144:K

┌───────────┬───────┬───────┬───────┬──────┬───────┬────────┬────┐

│ Серовар │Глюкоза│Лактоза│Дульцит│Сорбит│Салицин│Лизин- │Био-│

│ │ │ │ │ │ │декарбо-│вар │

│ │ │ │ │ │ │ксилаза │ │

├───────────┼───────┼───────┼───────┼──────┼───────┼────────┼────┤

│0144:K:H- │+ │(+) │- │- │- │- │1 │

│0144:K:H4 │++ │+ │- │+, (+)│(+) │+ │2 │

│0144:K:H18 │++ │- │(+) │(+) │-, (+) │- │3 │

│0144:K:H25 │ │ │ │ │ │ │ │

└───────────┴───────┴───────┴───────┴──────┴───────┴────────┴────┘

Таблица 44

БИОВАРЫ E. COLI 0124:K72

┌──────────────┬────────┬────────┬───────┬───────┬────────┬──────┐

│ Серовар │Глюкоза │Лактоза │Дульцит│Рамноза│Салицин │Биовар│

│ │ │ │ │ │ │ │

├──────────────┼────────┼────────┼───────┼───────┼────────┼──────┤

│0124:K72:H- │++, + │+ │- │(+) │- │1 │

│0124:K72:H30 │ │ │ │ │ │ │

│0124:K72:H30 │++, + │(+) │(+) │- │- │2 │

│0124:K72:H2 │++ │+ │(+) │+ │+ │3 │

│0124:K72:H12 │ │ │ │ │ │ │

└──────────────┴────────┴────────┴───────┴───────┴────────┴──────┘

Определение биоваров клебсиелл

Различия в биохимической активности Klebsiella pneumoniae по отношению к дульциту, сорбиту и D-тартрату могут быть использованы для подразделения их на биовары, перечень и характеристика которых приведены в таблице 45.

Таблица 45

БИОВАРЫ K. PNEUMONIAE

┌────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│ Тест- │ Биовары │

│ субстрат ├─────┬──────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┤

│ │ a │ b │ c │ D │ Da │ Db │ Dc │ Dd │

├────────────┼─────┼──────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┤

│Дульцит │- │- │- │- │+ │+ │+ │+ │

│Сорбоза │- │- │+ │+ │- │- │+ │+ │

│D-Тартрат │+ │- │+ │- │+ │- │+ │- │

└────────────┴─────┴──────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┘

Определение биоваров Y. enterocolitica

В основе определения биоваров у Y. enterocolitica лежит неодинаковая биохимическая активность этих бактерий по отношению к трегалозе, D-ксилозе, салицину (или эскулину) и способность образовывать индол, что позволяет подразделить их на 5 различных биоваров, характеристика которых представлена в таблице 46.

Таблица 46

БИОВАРЫ Y. ENTEROCOLITICA

┌─────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐

│ Биовары │ Тест или субстрат │

│ ├─────────────┬─────────────┬────────────┬─────────────┤

│ │ трегалоза │ Д-ксилоза │ индол │ салицин │

├─────────┼─────────────┼─────────────┼────────────┼─────────────┤

│1 │+ │+ │+ │+ │

│2 │+ │+ │+ │- │

│3 │+ │+ │- │- │

│4 │+ │- │- │- │

│5 │- │- │- │- │

└─────────┴─────────────┴─────────────┴────────────┴─────────────┘

4.3. Фаготипирование

Определение фаговаров у микроорганизмов вообще, в т.ч. и у некоторых энтеробактерий, основано на избирательной чувствительности отдельных штаммов одного и того же серовара к набору стандартных типовых бактериофагов, при этом фаговар устанавливают в соответствии с чувствительностью штамма к одному или нескольким определенным типовым бактериофагам, входящим в набор <*>.

--------------------------------

<*> Фаготипирование трех сероваров сальмонелл: S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B (S. schottmuelleri) проводится с использованием соответствующих наборов типовых бактериофагов, выпускаемых Тбилисским НИИ вакцин и сывороток МЗ СССР.

Определение фаговаров S. typhi

Для определения фаговаров S. typhi используют стандартную схему с применением 45 препаратов, адаптированных Vi II-бактериофагов и неадаптированного Vi I-бактериофага, предназначенного для выявления в культуре Vi-антигена. Бактериофаги и соответствующие им фаговары штаммов обозначают заглавными буквами латинского алфавита (от A до T включительно) и частично арабскими цифрами (от 27 до 46). Условием для определения фаговара культуры является наличие в ней Vi-антигена, с которым связана чувствительность ее к Vi-бактериофагам.

Если штамм дает слабую реакцию Vi-агглютинации, а результаты определения фаговара нечеткие, штамм рассевают и под контролем Vi-сыворотки отбирают колонии, наиболее богатые Vi-антигеном, которые вновь подвергают исследованию на определение фаговара. Для отбора колоний 3 - 4-часовую бульонную культуру высевают на чашку со СПА. Вторым обязательным условием для определения фаговара является использование типовых Vi II-бактериофагов в рабочих тест-разведениях, которые указывают либо в приложении к набору, либо на этикетках ампул с фагом.

Фаговар культуры определяют в соответствии с приведенной схемой (табл. 47), включающей 45 бактериофагов, позволяющих выявить такое же число фаговаров.

Таблица 47

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОВАРОВ S. TYPHI

Фа- го- ва- ры	Бактериофаги
Фа- го- ва- ры	А	B1	B2	B3	C1	C2	C3	C4	C5	C6	C7	D1	D2	D4	D5	D6	D7	D8	E1	E2	E5	E10	F1	F2	F4	F5	G	H	J1	J2	K	L1	L2	N1	N2	N	O	T	27	28	38	39	40	42	46	Vi-I
A	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL
B1	+/-	CL	-	+++	-	-	+	+++	-	+	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-	+	-	+	-	+++	+++	-	++	++	++	SCL	+++	+++	CL	+++	CL	CL
B2	++	-	CL	++	+++	-	-	-	-	-	-	++	++	+++	+++	-	+++	++	+++	-	+++	SCL	+++	-	+++	+++	+++	+++	SCL	-	++	+++	++	+++	+++	CL	-	SCL	SCL	CL	CL	CL	-	++	-	CL
B3	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	+++	+++	-	-	-	-	SCL	-	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	SCL	+++	+/-	SCL	SCL	CL	CL	CL	CL	CL	SCL	CL	SCL	CL	-	SCL	CL	CL
C1	+	+++	++	+++	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	+	-	+	++	++	+++	+	++	-	+/-	++	++	+++	-	+++	++	+	++	+++	-	++	-	++	++	+/-	-	++	+/-	SCL	SCL	+++	CL	+/-	+/-	CL
C2	-	-	-	-	-	CL	+	-	-	-	-	+	-	-	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	CL
C3	-	-	-	-	-	CL	CL	+	-	+	+	-	-	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	-	-	+/-	+/-	+	-	+/-	+/-	++	-	-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	CL	+/-	-	CL
C4	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
C5	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
C6	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
C7	-	-	-	-	-	-	-	+++	+	+++	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++	+/-	-	-	++	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
D1	-	+/-	-	-	+/-	CL	-	-	-	-	-	CL	CL	CL	CL	CL	CL	CL	-	-	-	+/-	-	+/-	-	+/-	+	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	+/-	+/-	+/-	-	++	CL
D2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	+/-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
D4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-
D5	-	+/-	-	-	+/-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	CL	-	CL	+/-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	+	-	+	CL
D6	-	-	-	-	-	SCL	+++	-	-	-	-	+	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	CL	+++	+/-	CL
D7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
D8	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
E1	-	+	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	CL	CL	CL	+/-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	+/-	+/-	+/-	-	SCL	CL
E2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	CL
E5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
E10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
F1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	CL	CL	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	CL
F2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
F4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	+++	CL	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
F5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
G	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	+/-	CL
H	-	+	+	+	+	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	+/-	-	+/-	-	+/-	-	+/-	++	+	CL	+/-	+	+/-	+/-	+/-	+	+	+/-	-	+/-	-	+++	+	+++	+++	+/-	CL	CL
J1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
J2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
K	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL
L1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	CL	-	-	-	-	-	-	+/-	+/-	-	-	-	+/-	CL
L2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	CL	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	+/-	+/-	CL
N1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-
N2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-
N	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	CL	-	+/-	-	-	-	-	-	-	+/-	CL
O	-	-	-	+++	-	-	-	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++	+++	-	CL	-	-	+++	++	-	CL	SCL	CL	CL
T	-	+++	-	-	-	-	+++	+++	-	-	-	+++	-	+/-	+/-	+++	-	-	-	-	-	CL	-	+++	-	CL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	CL	-	CL	++	CL	CL	+++	+	CL
27	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	-	CL	CL
28	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	SCL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	SCL	+/-	-	-	CL
38	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	-	-	CL
39	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	+/-	-	+/-	-	-	+/-	-	+/-	-	+/-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	+/-	CL	-	-	-	CL
40	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	CL	-	-	CL
42	-	++	-	SCL	++	-	+++	CL	-	SCL	SCL	-	-	-	-	-	CL	-	+++	-	++	-	+++	SCL	-	+++	+++	+++	-	CL	-	-	-	+++	SCL	-	+++	-	-	+++	+++	+++	CL	CL	CL	CL
46	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++	-	-	-	-	SCL	-	-	-	CL	CL

Обозначения: CL - сливной лизис; SCL - полусливной лизис; "+++" - отдельные негативные колонии (более 20); "++" - отдельные негативные колонии (до 20); "+/-" - единичные колонии; "-" - отсутствие лизиса.

Штаммы фаговара A лизируются всеми Vi II-фагами. Подразделение фаговара на подфаговары в группах B, C, D, E и т.д. построено таким образом, что штаммы подфаговара с порядковым номером 1 (B1, C1, D1, E1 и т.д.) лизируются не только гомологичным фагом, но и всеми другими фагами данной группы.

Для штаммов некоторых фаговаров (B1, B2, B3, C) характерна чувствительность к ряду фагов, в т.ч. и неродственных групп.

Для проведения этого исследования суточную агаровую культуру изучаемого штамма (после проверки на содержание в ней Vi-антигена с помощью Vi-сыворотки) пересевают в пробирку с 2 - 3 мл мартеновского или хоттингеровского бульона (pH 7,0 - 7,2) и инкубируют в термостате при 37 °C 3 - 4 час. Молодую бульонную культуру вносят в чашку Петри с 25 - 30 мл 1,5 - 1,7-процентного СПА, хорошо подсушенного. Чашки с агаром готовят накануне, оставляя их в термостате с закрытыми крышками, а на следующий день подсушивают с открытыми крышками в течение 20 - 30 мин. Культуру наносят на агар в чашке петлей (диаметром 5 мм) или тонко оттянутой пастеровской пипеткой в виде отдельных капель. Число капель культуры должно быть на 3 единицы больше числа используемых бактериофагов: одну из них испытывают с Vi I-фагом, вторую с O-поливалентным сальмонеллезным фагом и третья капля служит контролем культуры (вместо фага на нее наносят каплю бульона). Культуру можно засеять на чашку в виде сплошного газона, на который после подсыхания наносят петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой Vi II-бактериофаги в тест-разведениях, а также Vi I- и O-фаги. После подсыхания капель фага чашки оставляют в термостате при 37° C и учитывают результаты дважды (через 5 - 6 час. и 18 - 20 час.). Учет проводят невооруженным глазом или с помощью 5-кратной лупы через дно чашки в проходящем свете. Фаговар культуры определяют в соответствии с указанной схемой. При определении фаговаров возможны результаты, отклоняющиеся от указанных в схеме: а) культура лизируется Vi-фагом, но нечувствительна ни к одному из Vi II-бактериофагов. Причина этого: выделение штамма, к которому Vi II-фаги еще не открыты или отсутствуют в используемом наборе; изучаемый штамм относится к тем культурам, к которым Vi II-бактериофаги не могут быть адаптированы (Vi I-штаммы); б) культура содержит Vi-антиген, лизируется несколькими Vi II-фагами, но спектр лизиса не соответствует ни одному из представленных в схеме (полилизабельные, деградированные штаммы), для их успешного исследования рекомендуется изучить несколько колоний (2 - 4), т.к. некоторые из них могут сохранять признаки определенного фаговара. Нередко полилизабельные культуры проявляют выраженную однотипность в спектре чувствительности к Vi II-бактериофагам, что может быть использовано как эпидемиологическая метка при выделении таких штаммов от разных лиц или других источников; в) культуры, не обладающие Vi-антигеном, хорошо лизирующиеся O-фагом и не чувствительные ни к одному из Vi-фагов, обозначают как W-форму.

Определение фаговаров S. paratyphi B

Для определения фаговаров S. paratyphi B используют международную стандартную схему Феликса и Келлоу (10 фагов), дополненную 5 фагами <*>. С помощью этой схемы удается установить 10 основных фаговаров S. paratyphi B и 19 их постоянных подфаговаров. Определение фаговаров S. paratyphi B основано на определении спектра лизиса несколькими фагами. Методика определения фаговаров та же, что для S. typhi, однако для S. paratyphi B делают две дополнительные капли культуры (одна для испытания с O-фагом, другая для контроля культуры).

--------------------------------

<*> Выпускаются Тбилисским научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток.

Таблица 48

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОВАРОВ S. PARATYPHI B

┌──────────┬──────────────────────────────────────────────┬───────────────────────┐

│ Фаговары │ Бактериофаги │ │

│ штаммов ├──┬──┬────┬───┬────┬────┬─────┬────┬────┬─────┼──┬──┬──┬───┬───┬──────┤

│ │1 │2 │ 3a │3b │Yer-│Bec-│Taun-│BAOR│Dun-│Work-│c │d │e │ f │ h │Приме-│

│ │ │ │ │ │sey │cles│ton │ │dee │sop │ │ │ │ │ │чание │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │<*> │

├──────────┼──┼──┼────┼───┼────┼────┼─────┼────┼────┼─────┼──┼──┼──┼───┼───┼──────┤

│1 │CL│L │+++ │+ │CL │- │- │- │OL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(1) │

│1 var.1 │CL│CL│++++│- │CL │SCL │SCL │+++ │SCL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(1) │

│1 var.1 │CL│CL│++++│+++│CL │SCL │SCL │++++│SCL │- │CL│CL│CL│SCL│SCL│(Q) │

│2 │- │CL│- │- │+ │- │- │- │CL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(2) │

│2 var.1 │- │CL│- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(2) │

│3a │- │- │CL │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+++ │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a │- │- │CL │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+++ │CL│CL│- │SCL│SCL│(S) │

│3a var.2 │- │- │CL │SCL│- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a 1 │- │- │CL │- │- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a 1 │- │- │CL │- │- │- │- │- │- │- │CL│- │CL│- │SCL│(W) │

│3a 1 │- │- │CL │- │- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│CL│CL │SCL│(Q) │

│3a 1 var.1│- │- │CL │- │- │SCL │SCL │/OL/│SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a 1 var.1│- │- │CL │- │- │SCL │SCL │/OL/│SCL │- │CL│CL│CL│SCL│SCL│(Q) │

│3b │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+ │- │CL│- │- │SCL│(A) │

│3b │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+ │CL│CL│- │- │SCL│(BT) │

│3b │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+ │- │CL│CL│- │SCL│(P) │

│3b var.1 │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│- │- │CL│- │CL│- │SCL│(M) │

│Yersey │- │- │- │- │OL │SCL │SCL │/OL/│SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(Y) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(A) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(BT) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │- │CL│CL│- │SCL│P │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │CL│CL│- │- │- │(BM) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │/OL/│- │- │CL│- │CL│- │SCL│(W) │

│var.1 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Taunton │- │- │- │- │- │- │SCL │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│Taunton │- │- │- │- │- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│(Dundee) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│BAOR │- │- │- │+ │- │- │- │OL │- │- │CL│- │CL│- │SCL│(W) │

│BAOR │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │CL│- │CL│- │SCL│(M) │

│(н.т.) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Dundee │- │- │- │- │- │- │- │- │SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(A) │

│Worksop │- │- │- │- │- │- │- │- │- │SCL │- │- │- │- │- │(-) │

└──────────┴──┴──┴────┴───┴────┴────┴─────┴────┴────┴─────┴──┴──┴──┴───┴───┴──────┘

--------------------------------

<*> Обозначения фаговаров по спектру реакций штаммов с типовыми бактериофагами Тбилисского НИИВС - c, d, e, f, h.

Обозначения: CL - сливной лизис; SCL - полусливной лизис; OL - лизис со вторичным ростом; /OL/ - непостоянная реакция; "++++" - отдельные негативные колонии (более 20); "+++" - отдельные негативные колонии (до 20); "+" - единичные негативные колонии; "-" - отсутствие лизиса.

Определение фаговара культуры проводят в соответствии с приведенной схемой (табл. 48), используя соответствующие фаги. Следует иметь в виду, что изучаемый штамм может отклоняться от указанных в схеме спектров лизиса, например, не лизироваться ни одним из типовых бактериофагов (его обозначают как отрицательный) либо лизироваться несколькими фагами, не укладываясь в установленные схемой фаговары (его обозначают как нетипируемый).

Определение фаговаров S. paratyphi A

Определение фаговара S. paratyphi A осуществляют в соответствии с международной схемой, включающей 6 специфических бактериофагов, с помощью которых удается установить 6 фаговаров этих бактерий, обозначаемых арабскими цифрами 1, 2, 3, 4, 5, 6 (табл. 49).

Таблица 49

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОВАРОВ S. PARATYPHI A

┌──────────────┬───────┬────────┬────────┬───────┬───────┬───────┐

│ \ Типовые│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │

│ \ фаги │ │ │ │ │ │ │

│Фаговары \ │ │ │ │ │ │ │

├──────────────┼───────┼────────┼────────┼───────┼───────┼───────┤

│1 │CL │CL │CL │CL │CL │CL │

│2 │- │CL │- │- │- │CL │

│3 │- │- │CL │- │- │- │

│4 │++ │++ │- │CL │+++ │- │

│5 │- │- │- │- │CL │- │

│6 │- │- │- │- │- │CL │

└──────────────┴───────┴────────┴────────┴───────┴───────┴───────┘

Обозначения: CL - сливной лизис; "+++" - отдельные негативные колонии (более 10); "++" - отдельные негативные колонии (менее 10); "-" - отсутствие лизиса.

Установление фаговара основано на определении четких спектров лизиса изучаемых штаммов S. paratyphi A бактериофагами определенных типов (фаговары 3, 5 и 6) или группами фагов (фаговары 1, 2 и 4).

Методика определения фаговаров та же, что для S. typhi и S. paratyphi B. Следует отметить, что наибольший успех при определении фаговара S. paratyphi A (равно как при определении фаговара S. paratyphi B) достигается в том случае, если изучению подвергается не одна, а несколько (2 - 4) культур, полученных из отдельных колоний исследуемого штамма.

4.4. Типирование шигелл по колициногенной активности <*>

--------------------------------

<*> См. "Методические материалы по внутривидовому типированию дизентерийных бактерий Зонне по колициногенности и колициночувствительности". МЗ СССР, 1971.

Метод определения колициногенной активности у шигелл основан на свойстве этих бактерий продуцировать колицины с неодинаковым спектром действия на индикаторные бактерии.

Принятый в нашей стране метод определения колициногеноваров у S. sonnei предусматривает использование 10 индикаторных штаммов (8 штаммов S. sonnei, S. dysenteriae 2 и одного - E. coli) из набора Эббота и Шеннона. С их помощью могут быть установлены 17 колициногеноваров (табл. 50). Еще 5 индикаторных штаммов (S. sonnei) из упомянутого набора применяют для уточнения характеристик, если результаты определения колициногеновара по основной схеме вызывают сомнения или необходимость их подтвердить.

Таблица 50

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЦИНОГЕННОЙ

АКТИВНОСТИ S. SONNEI ПО ЭББОТУ И ШЕННОНУ

(В МОДИФИКАЦИИ Н.А. СМИРНОВОЙ-МУТУШЕВОЙ, 1968)

┌───────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│Коли- │ Индикаторные штаммы <*> │

│цино- ├─────────────────────────────────┬──────────────────────┤

│геновар│ Для постоянного │ Для уточнения │

│(услов-│ пользования │ характеристик │

│ный) ├──┬──┬──┬──┬──┬────┬──┬──┬───┬───┼───┬────┬────┬────┬───┤

│ │31│32│33│37│39│8218│41│42│43 │44 │34 │ 35 │ 36 │ 38 │40 │

├───────┼──┼──┼──┼──┼──┼────┼──┼──┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼───┤

│ 1 │2 │3 │4 │5 │6 │ 7 │8 │9 │10 │11 │12 │ 13 │ 14 │ 15 │16 │

├───────┼──┼──┼──┼──┼──┼────┼──┼──┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼───┤

│1A │+ │+ │+ │+ │- │+ │- │- │- │- │- │- │+ │- │- │

│1B │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │

│2 │- │+ │+ │- │+ │- │- │- │- │+ │- │- │- │- │- │

│3 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │

│3A │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │

│4 │+ │+ │+ │- │+ │- │+ │+ │- │+ │X │+ │- │+ │+ │

│5 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │X │+ │+ │+ │+ │

│6 │- │+ │- │+ │+ │- │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │

│7 │- │- │+ │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │

│8 │+ │- │+ │- │- │- │- │+ │- │+ │- │+ │- │+ │- │

│9 │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │+ │- │+ │- │X │+ │+ │- │

│10 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │- │+ │- │+ │+ │+ │- │

│11 │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │

│12 │+ │+ │- │+ │+ │- │- │+ │- │+ │- │+ │+ │+ │- │

│13 │- │+ │+ │+ │+ │- │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │

│14 │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│15 │+ │- │+ │- │- │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │

└───────┴──┴──┴──┴──┴──┴────┴──┴──┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴───┘

--------------------------------

<*> Условные обозначения индикаторных штаммов соответствуют следующим наименованиям оригинальных штаммов: 31 - S. sonnei 2; 32 - S. sonnei 56; 33 - S. sonnei 17; 37 - S. sonnei 56/98; 39 - S. sonnei R6; 8218 - S. dysenteriae 2 N 19; 41 - S. sonnei 3/64; 42 - S. sonnei 2/15; 43 - S. sonnei R5; 44 - E. coli K-12 ROW; 34 - S. sonnei 2M; 35 - S. sonnei 38; 36 - S. sonnei 56/56; 38 - S. sonnei RT; 40 - S. sonnei 2/7.

Обозначения: "+" - торможение роста; "-" - отсутствие торможения; X - вариабельные результаты.

Исследование проводят способом перекрестных посевов. Для этого суточную бульонную культуру исследуемого штамма сеют на агаровую пластинчатую среду в виде двух параллельных полос, располагающихся по обе стороны предполагаемой линии диаметра чашки таким образом, чтобы расстояние между полосами посева составляло 3 - 4 см. В качестве питательной среды (в чашках) применяют коммерческий питательней агар "Д" или приготовленный в лаборатории 1,5-процентный СПА на гидролизате Хоттингера с конечным содержанием аминного азота в среде 130 - 150 мг и pH 7,4. С целью предотвращения роста воздушной флоры к агару добавляют раствор генцианвиолета (2 - 4 капли 0,1-процентного водного раствора на 100 мл среды), известно также, что он стимулирует колицинопродукцию.

Чашки с указанными посевами инкубируют при 37 °C в течение 48 часов. Этот срок необходим для накопления в среде колицинов в концентрации, достаточной для проявления их действия на индикаторные штаммы. После инкубации в крышку чашки наливают 0,5 мл хлороформа и закрывают ее второй половиной той же чашки (с выросшей культурой), выдерживая экспозицию 40 - 50 мин. Обезвреженную культуру снимают узким краем стерильного предметного стекла, стараясь сохранить целостность агаровой поверхности; далее под прямым углом к линиям посева исследуемого штамма на агар наносят бактериологической петлей 4-х часовые бульонные культуры индикаторных штаммов в виде поперечных полос. Посевы делают таким образом, чтобы полосы посевов на одной половине чашки помещались против интервалов между полосами посевов на другой половине чашки. Рекомендуется постоянно соблюдать однотипный порядок расположения посевов индикаторных штаммов, что позволяет не делать специальные пометки на чашках. При использовании 10 или 15 индикаторных штаммов соответственно делают на каждой половине чашки 6 и 4 или 8 и 7 полос.

Чашки с посевами индикаторных штаммов инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов. При учете результатов прежде всего необходимо установить, является ли исследуемый штамм колициногенным. Показателем колициногенности является торможение роста индикаторного штамма 44 (E. coli K-12 ROW), чувствительного ко всем известным колицинам, кроме колициногеновара 7 типа (к нему чувствителен штамм 33). Наряду с этим может иметь место торможение роста еще каких-либо индикаторных штаммов.

При изучении спектра зон задержки положительным результатом считают наличие зоны торможения роста индикаторных бактерий более 4 мм. Сопоставляя полученные результаты со схемой (табл. 50) устанавливают условный колициногеновар. Однако литический спектр может не соответствовать ни одному из условных колициногеноваров. Такие штаммы обозначают как нетипируемые.

При применении метода колициногенотипирования необходимо проводить периодический контроль за стабильностью свойств индикаторных штаммов с помощью набора стандартных колициногенных штаммов.

4.5. Типирование шигелл по чувствительности к колицинам

Чувствительность S. sonnei и других видов шигелл к колицинам (колициновар) связано со способностью бактерий адсорбировать на рецепторах поверхности клетки определенные колицины; колицины (или группа родственных колицинов) адсорбируются на строго специфических рецепторах.

Этот метод применяют к разным видам шигелл (в целом занимающих одно из первых мест по чувствительности к колицинам среди всех родов энтеробактерий), т.к. они мало отличаются по удельному весу колициночувствительных штаммов. Вместе с тем использование этого метода в эпидемиологических целях ограничено из-за относительной нестабильности колициноваров.

Для определения колициноваров используют 11 эталонных колициногенных штаммов из коллекции P. Frederiq. Перечень их представлен в таблице 51. Перед началом исследования готовят чашки с 1,5-процентным СПА, разливая его по 20 - 25 мл на чашку с добавлением генцианвиолета (2 - 4 капли 0,1-процентного водного раствора на 100 мл среды). Определение проводят в двух (дублирующих) чашках. Дно каждой чашки со средой разделяют на 11 квадратов - по числу эталонных штаммов, обозначая их условно 1, 2, 3 и т.д. соответственно порядковому номеру при использовании этих штаммов. В квадраты сеют последовательно уколом петли суточные бульонные культуры указанного набора колициногенных штаммов. Чашки с посевами инкубируют при 37 °C в течение 22 - 24 часов, затем обеззараживают однократно хлороформом, как было описано выше (удаление обезвреженной бактериальной массы не требуется). По окончании этой процедуры 2 капли 6-часовой бульонной культуры исследуемого штамма вносят в пробирку с 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 46 - 48 °C полужидкого (0,7%) СПА и после перемешивания агар наслаивают на 1-й слой агара. В результате предшествовавшего культивирования посевов эталонных колициногенных штаммов в толще 1-го слоя агара колицины диффундировали в среду вокруг макроколоний.

Таблица 51

ЭТАЛОННЫЕ КОЛИЦИНОГЕННЫЕ ШТАММЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

КОЛИЦИНОВАРОВ ШИГЕЛЛ P. FREDERIQ)

┌────────────────────────────────┬───────────────────────────────┐

│ Наименование штамма │ Продуцируемый колицин │

├────────────────────────────────┼───────────────────────────────┤

│E. coli CA-18 │B │

│E. coli CA-23 │D │

│E. coli CA-38 │E+I │

│E. coli CA-42 │Y │

│E. coli CA-53 │I │

│E. coli K-235 │K │

│E. coli CA-62 │J+I │

│E. coli CA-7 │V │

│S. boydii P-1 │S │

│ │ I │

│S. boydii P-9 │S +I │

│ │ 3 │

│B. dispar P-14 │S │

│ │ 5 │

└────────────────────────────────┴───────────────────────────────┘

Через 16 - 20 часов инкубации при 37 °C вокруг макроколонии эталонных штаммов во 2-ом слое агара образуются зоны задержки роста испытуемого штамма, если он колициночувствителен. Штамм считают чувствительным, если величина зоны задержки его роста, измеряемой от края макроколонии эталонного колициногенного штамма до наружного края зоны, составляет 2 мм.

При оценке результатов учитывают степень чувствительности к колицинам по системе 4 полюсов: зона до 2 мм "+", от 2 до 5 мм "++", от 4 до 10 мм "+++" и более 10 мм "++++". Для получения четких результатов имеет значение использование правильно приготовленной агаровой среды, особенно в отношения количественного содержания в среде агара (1,5%), в более плотной среде диффузия колицинов в агар замедляется. Важно также обеспечить равномерное распределение инокулята во 2-ом слое (полужидкого) агара.

Изучение спектра лизиса проводят в обеих чашках, если он однороден, типирование считают законченным. При расхождении результатов исследование повторяют. Дублированное исполнение процедур по колицинотипированию диктуется необходимостью исключения технических погрешностей, могущих влиять на спектр чувствительности к колицинам исследуемого штамма.

Установленный колициновар отражает спектр колицинов, к которым исследуемый штамм оказался чувствительным (табл. 51).

4.6. Другие методы типирования

В качестве эпидемиологических маркеров может быть использована и нередко используется характеристика чувствительности штаммов энтеробактерий к различным антибактериальным лекарственным препаратам и в первую очередь к антибиотикам.

В этом случае маркером служит спектр антибиотикорезистентности.

Обычно у штаммов, происходящих от эпидемиологически связанных случаев, спектры резистентности оказываются сходными. Достаточно успешным этот метод маркирования может оказаться при расшифровке вспышек заболеваний, вызванных энтеробактериями, в особенности, если другие методы определения эпидемиологических маркеров не дают желаемого результата.

Вместе с тем следует учитывать, что этот метод маркировки не всегда достаточно надежен вследствие возможности генетического обмена у энтеробактерий факторами, контролирующими резистентность, и соответственно возможности изменения антибиотикограмм.

Тем не менее, систематическое слежение за чувствительностью выделяемых энтеробактерий на той или иной территории имеет важное не только эпидемиологическое, но и клиническое значение.

Установление антибиотикограммы проводят с помощью известных методов определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам, в числе которых наиболее приемлемым для использования в практических условиях является метод диффузии в агар с применением набора коммерческих стандартных дисков с антибиотиками <*>.

--------------------------------

<*> См. "Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агаре с использованием дисков", МЗ СССР, 1983.

5. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ

И БАКТЕРИОНОСИТЕЛЬСТВА

С целью улучшения диагностики заболеваний, вызываемых энтеробактериями, а также при проведении эпидемиологического анализа и выявления источников инфекции следует применять серологические исследования и, в частности, определять в сыворотке крови антитела к антигенам соответствующих возбудителей. Наибольшее значение серологические исследования приобрели в диагностике брюшного тифа, паратифов и других сальмонеллезов, в меньшей степени - при дизентерии. В случае выделения УПЭ серологические исследования могут также иметь определенное значение при оценке этиологической роли выделенных микробов.

Необходимо учитывать, что наиболее специфичным и чувствительным методом титрования антител является реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА). Для постановки РПГА с целью выявления антител к O-антигенам возбудителей брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии применяют коммерческие стабильные эритроцитарные диагностикумы. При отсутствии эритроцитарных O-диагностикумов, а также для выявления H-антител применяют реакцию агглютинации (типа Видаля) с соответствующими коммерческими O- и H-диагностикумами <*>. Для серологической диагностики инфекций, вызываемых УПЭ (Esherichia, Yersinia, Citrobacter, Proteus и др.), коммерческие препараты не выпускают, поэтому реакцию агглютинации ставят с аутоштаммами.

--------------------------------

<*> См. "Каталог препаратов для диагностики бактериальных инфекций", М., 1981.

При постановке любой из указанных серологических реакций следует учитывать одно принципиально важное обстоятельство. Человеческий организм в течение жизни многократно встречается с различными энтеробактериями и их антигенами, поэтому в крови многих практически здоровых людей могут присутствовать (иногда в значительных титрах) антитела к этим антигенам. Вследствие этого понятие "диагностический" титр определяемых антител носит лишь весьма условный ориентировочный характер. Следует учитывать и то, что для разных районов страны (в связи с особенностями эпидемической ситуации и др.) величина "диагностического" титра будет различной. Ее устанавливают в результате титрования сывороток от 100 - 200 здоровых лиц. Существенно большее диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем - в конце первой или в начале второй недели болезни. В более поздние сроки заболевания титр антител к специфическому антигену снижается, что также может служить диагностическим признаком.

Значительную помощь для постановки более обоснованного диагноза оказывает определение не только общего (суммарного) титра антител без дифференциации их на классы иммуноглобулинов, но и антител, относящихся к классу иммуноглобулинов G (IgG). Нормальные (так называемые неспецифические), анамнестические и прививочные антитела, особенно к O-антигенам бактерий, принадлежат в основном к иммуноглобулину M (IgM) и могут содержаться в довольно высоком титре у многих здоровых людей.

Определение относительного содержания в сыворотках IgG-антител основано на том, что эти антитела устойчивы к обработке некоторыми редуцирующими веществами и, в частности, цистеином, тогда как IgG-антитела инактивируются этими реагентами.

5.1. РПГА в диагностике брюшного тифа,

паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии

Кровь берут с соблюдением правил асептики из пальца с помощью оспопрививательных игл или шприцом из вены в стерильную пробирку. После образования сгустка его отделяют от стенок стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой и ставят пробирку в холодильник. Не позднее чем через 24 часа после взятия крови отсасывают сыворотку. Если сыворотка содержит примесь эритроцитов, ее центрифугируют.

Для постановки РПГА удобно использовать пластмассовые планшеты с лунками <*>, в которых готовят последовательные двукратные разведения исследуемых сывороток. С этой целью вначале в лунки планшета наливают по 0,5 мл ИХН. Отдельно разводят в 50 раз исследуемую сыворотку (например, 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл ИХН), 0,5 мл сыворотки в этом разведении вносят в первую лунку. Содержимое лунки тщательно перемешивают градуированной пипеткой и 0,5 мл переносят во вторую лунку, а из второй после перемешивания - в третью и т.д. Обычно достаточно таким способом приготовить ряд из 5 - 6 разведений (до разведения 1:1600 - 1:3200). Из последней лунки 0,5 мл содержимого выливают и вносят во все лунки чистой пипеткой по 0,25 мл необходимого эритроцитарного диагностикума, ампулу с которым перед этим тщательно взбалтывают до полного исчезновения осадка эритроцитов. С целью экономии диагностикумов их можно вносить по 3 капли (не по 0,25 мл, а по 0,15 мл). Пластины осторожно несколько раз встряхивают до получения гомогенной взвеси эритроцитов и ставят на 2 - 3 часа в термостат при 37 °C или на ночь при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

--------------------------------

<*> ТУ 64-2-273-79.

Контролями диагностикума служат: 1) постановка реакции со стандартной иммунной сывороткой, вложенной в каждую упаковку диагностикума, - реакция должна быть положительной до разведения, указанного на ампуле с сывороткой; 2) постановка реакции с 0,5 мл ИХН в 2-х лунках - реакция должна быть отрицательной.

Реакция гемагглютинации считается положительной в том случае, если эритроциты полностью агглютинировались и расположены равномерно по дну лунки либо наряду с равномерно расположенными набольшая часть эритроцитов оседает в центре лунки в виде ровного колечка или "пуговки". Иногда при положительной реакции края агглютината в лунках могут слегка оползать, и он принимает вид "зонтика". При отрицательном результате агглютината нет, а эритроциты оседают в центре лунки в виде "пуговки" или ровного колечка.

При необходимости определения IgG-антител следует использовать L- или DL-цистеин как солянокислый, так и "свободный". Препарат должен быть чистым и содержать золу в виде сульфатов не более 0,2%, аммиак - не более 0,05%. Этим требованиям отвечает венгерский цистеин. Непосредственно перед обработкой сывороток готовят раствор цистеина (7 мг на 1 мл растворителя - для L-цистеина и 20 мг - для DL-цистеина). При этом солянокислый цистеин растворяют в 0,1 N растворе едкого натрия с таким расчетом, чтобы pH готового раствора был равен 7,0 - 7,2. "Свободный" цистеин сначала растворяют в половинном количестве ИХН, затем доводят pH до 7,0 - 7,2 0,1 N раствором едкого натрия и вновь доливают до нужного объема ИХН, т.к. "свободный" цистеин значительно слабее, чем солянокислый, сдвигает pH раствора в кислую сторону. Допустимо использование отечественного цистеина, который предварительно должен быть проверен, причем эталоном может служить венгерский или другой проверенный цистеин. С целью проверки pH применяют индикаторную бумагу. Раствор цистеина не может храниться длительное время, поэтому следует вначале приготовить необходимое разведение сыворотки.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 смешивают с равным объемом цистеина, помещают в небольшие пробирки или флаконы и плотно закрывают их резиновыми пробками (лейкопластырем). Объем пробирок (флаконов) должен быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное свободное пространство во избежание инактивации цистеина кислородом воздуха. Пробирки с сыворотками, обработанными цистеином, выдерживают в течение 18 - 20 часов в термостате при 37 °C. В таких же условиях выдерживают вторую часть исследуемой сыворотки (без цистеина), разведанную 1:10 с применением ИХН. На следующий день обе части сыворотки титруют, начиная с разведения 1:20. В качестве основы для титрования сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный ИХН (фосфатный буфер, pH 7,0 - 7,2), однако предпочтительней готовить ИХН на нормальной, прогретой при 56 °C в течение 30 минут сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100 - 200 мл ИХН (pH 7,0 - 7,2) при условии, что в принятом разведении нормальной сыворотки отсутствуют антитела к применяемым диагностикумам. Это проверяют предварительно для каждой новой серии нормальной сыворотки.

С целью диагностики брюшного тифа и паратифов сыворотки следует титровать с помощью O-диагностикумов серогрупп A, B и D, а также H-диагностикумов I фазы a, b, d и Vi-диагностикума. Четкое нарастание в динамике болезни титра суммарных антител к определенным антигенам и особенно увеличение уровня IgG-антител, устойчивых к цистеину, дает веские основания для подтверждения клинического диагноза. Необходимо учитывать, что при паратифе A титры O-антител на протяжении заболевания могут быть ниже, чем при брюшном тифе и паратифе B.

В случае позднего поступления больного в стационар (в разгар болезни) условно диагностическим титром суммарных O- и H-антител следует считать положительный результат в разведении не ниже 1:640, а для Vi-антител - 1:80 - 1:100. Минимальным условно диагностическим титром IgG O- и H-антител считают разведение 1:80, а для IgG Vi-антител - 1:40 (при паратифе A диагностические титры могут быть в 2 раза ниже).

При позднем серологическом обследовании больного и отсутствии бактериологического подтверждения диагноза целесообразно исследовать сыворотку в периоде реконвалесценции, чтобы выявить снижение общего титра антител и уменьшение удельного содержания цистеинустойчивых IgG-антител, что также может помочь поставить правильный диагноз.

С целью диагностики сальмонеллезов сыворотки вначале титруют

комплексным диагкостикумом (серогрупп A, B, C , C , D и E). При нарастании

1 2

уровня антител или достаточно высоком титре (для взрослых - не ниже 1:400,

для детей до полугода - 1:100, для детей от 6 мес. до 1 года - 1:200)

следует повторить исследование сыворотки со всеми групповыми

O-диагностикумами и поставить РПГА с цистеиновой пробой. Это необходимо для

уточнения этиологии заболевания и потому, что комплексный диагностикум

недостаточно специфичен. Условно диагностическим титром суммарных антител

считают положительный результат реакции в разведении 1:400, а

цистеинустойчивых IgG-антител - 1:80 (для детей до 1 года - 1:20).

С целью диагностики дизентерии сыворотки титруют с эритроцитарными диагностикумами Флекснера (из S. flexneri 1 - 5), Зонне (из S. sonnei), Ньюкасл (из S. flexneri 6), Григорьева - Шига (из S. dysenteriae 1) и Штуцера - Шмитца (из S. dysenteriae 2). Минимальным условно диагностическим титром к диагностикуму Флекснера для взрослых считают положительный результат реакции в разведении 1:400, для детей до 3 лет - 1:100, старше 3 лет - 1:200; для остальных диагностикумов - 1:200. В связи с большим числом неспецифических положительных результатов этой реакции, в особенности в отношении диагностикумов Флекснера и Зонне, достоверным положительным результатом следует считать не менее чем четырехкратное нарастание титра в динамике заболевания, а также наличие титра цистеинустойчивых антител 1:80 и выше.

РПГА с цистеином может оказаться полезной для постановки правильного диагноза в случаях смешанной инфекции и при выделении двух или нескольких представителей энтеробактерий, этиологическая роль каждого из которых не ясна. При истинной микст-инфекции антитела и особенно цистеинустойчивые будут нарастать к каждому из предполагаемых возбудителей. Если же к какому-то из предполагаемых возбудителей нарастание антител, а в том числе IgG, не будет выявлено и при этом отсутствуют клинические симптомы заболевания, то можно считать, что выделение возбудителя носит случайный, транзиторный характер.

В случае формирования острого и особенно затяжного бактерионосительства (при брюшном тифе, паратифах, реже при сальмонеллезах и другие инфекциях) характерно выраженное нарастание IgG-антител, при этом основное значение имеет не абсолютный титр антител, а относительное содержание в сыворотке цистеинустойчивых антител. Если обработка цистеином не снижает титр либо снижает его только на одно, максимум на два разведения, это свидетельствует о значительном содержании в сыворотке IgG-антител, у такого обследованного следует заподозрить острое или хроническое бактерионосительство (при отсутствии клинических проявлений). При длительном бактерионосительстве титр O-антител может быть и низким (иногда 1:20 - 1:40), но эти антитела практически целиком определяются IgG-антителами. Для хронических носителей тифозных бактерий характерны довольно высокие титры Vi-антител (в большинстве случаев выше 1:80) и H-антител (1:320 и выше), которые почти не снижаются при обработке цистеином.

Отмеченная закономерность может нарушаться у хронических носителей тифозных бактерий, инвазированных описторхами. Это необходимо принимать во внимание при обследовании населения территорий, на которых распространен описторхоз.

РПГА с цистеином может быть применена с целью контроля прекращения бактерионосительства. Если на фоне прекратившегося бактериовыделения значительно снизится титр антител и особенно цистеинустойчивых IgG, то можно предположить, что произошло освобождение организма от возбудителя. Прекращение бактерионосительства чаще наблюдается при дизентерии, сальмонеллезах, значительно реже - при брюшном тифе.

Для транзиторных бактерионосителей характерен невысокий титр антител, обусловленный IgM. Если после обработки цистеином в сыворотке остаются IgG-антитела в титре 1:40 и выше, то у такого лица можно предполагать наличие либо субклинической формы инфекции, либо продолжающееся бактерионосительство.

Некоторое повышение титра IgG-антител может происходить в результате многократной специфической вакцинации, поэтому при анализе результатов реакции следует учитывать прививочный анамнез.

При выдаче ответа указывают: "Реакция гемагглютинации с диагностикумом ___________________ отрицательная"; "Реакция гемагглютинации с диагиостикумом ___________________ положительная до титра _________"; "Реакция гемагглютинации с цистеиновой пробой с диагиостикумом _______________ отрицательная"; "Реакция гемагглютинации с цистеиновой пробой с диагиостикумом ________________ положительная до титра ____________".

5.2. Реакция агглютинации с бактериальными диагностикумами

при диагностике брюшного тифа, паратифов,

других сальмонеллезов и дизентерии

Исследуемые сыворотки разводят тем же способом, что и для РПГА, только в пробирках. В каждый ряд агглютинационных пробирок с разведениями сыворотки и в контрольную (с 0,5 мл ИХН) добавляет по 2 капле соответствующего диагностикума, штатив с пробирками несколько раз встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на ночь. Учет результатов реакции рекомендуется проводить с помощью агглютиноскопа, осторожно встряхивая осадок или медленно наклоняя пробирку. При положительной реакции осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его часто бывают неровные (форма "зонтика"). Надосадочная жидкость прозрачна. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадочной жидкости всплывают хлопья или зерна агглютината. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдают хорошо выраженную агглютинацию, считают ее титром. При отрицательной реакции взвесь сохраняет исходную мутность так же, как в контроле диагностикума.

Условно диагностическим титром считают положительный результат реакции агглютинации с брюшнотифозными и другими сальмонеллезными диагностикумами в разведении 1:200, с диагностикумами Флекснера - 1:400, Зонна, Ньюкасл, Григорьева - Шига, Штуцера - Шмитц - 1:100.

Необходимо, однако, помнить, что эти титры не могут служить достоверным доказательством заболевания. Значительно более надежными следует считать увеличение титров в динамике болезни.

В ответе указывают: "Реакция агглютинации с диагностикумом ______________ отрицательная"; "Реакция агглютинации с диагностикумом _________________ положительная до титра ______________".

5.3. Реакция агглютинации с аутоштаммами в диагностике

заболеваний, вызываемых условно патогенными энтеробактериями

Диагностическая ценность этой реакции в значительной мере связана с выявлением характера антителообразования в динамике заболевания. Оптимальные сроки взятия сыворотки 1 - 2, 7 - 10, 14 - 15-й дни заболевания. Полученные от больного сыворотки следует сохранять в холодильнике и исследовать одномоментно ("парные сыворотки"). При специфическом иммунном ответе в конце первой - начале второй недели болезни титр антител нарастает не менее чем в 4 раза, а затем постепенно снижается.

При выделении подвижных культур, представителей родов Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Enterobacter, Proteus и др. сыворотку больных исследуют на H- и O-антитела.

Для H-агглютинации культуры выращивают на свежескошенном СПА в течение 18 часов, затем смывают ИХН и доводят взвесь бактерий до густоты 1 млрд./мл. В ряду из 5 обычных агглютинационных пробирок с 0,25 мл ИХН титруют исследуемую сыворотку, начиная с разведения 1:50, после чего вносят в каждую пробирку, включая одну контрольную с 0,25 мл ИХН, по 0,25 мл приготовленной бактериальной взвеси. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на ночь. Учитывают реакцию, осторожно покачивая пробирку. Агглютинат имеет вид хлопьев. При невозможности взятия сывороток в динамике болезни ориентировочным титром считают положительный результат реакции H-агглютинации в разведении 1:100 - 1:200.

Для O-агглютинации используют взвесь убитой кипячением суточной агаровой культуры бактерий густотой в 3 млрд./мл ИХН.

Перед постановкой реакции бактериальную взвесь необходимо 2 - 3 раза отмыть путем центрифугирования. Исследуемую сыворотку титруют в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10 на ИХН в серологических пробирках. В каждую пробирку, включая контрольную, вносят по 1 капле приготовленной бактериальной взвеси, штатив встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на ночь. В случае положительной реакции O-агглютинат при осторожном встряхивании имеет мелкозернистый характер. При невозможности обследования больного в динамике и получении лишь одной сыворотки позже 5 дня болезни условно диагностическим титром считают положительную реакцию в разведении 1:20 и выше.

В ответе указывают: "Реакция агглютинации с аутоштаммом ________________ отрицательная"; "Реакция агглютинации с аутоштаммом __________________ положительная до титра _____________________".