|
NN |
Фамилия, И., О. |
Возраст |
Дата |
Дата |
Результаты |
|
|
в |
в |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
При постановке реакции Шика следует
строго следить за введением токсина в середину левого предплечья. Введение
токсина в нижнюю часть предплечья не допускается. При неудачном введении
токсина (под кожу, неполная доза и т.д.) повторное введение запрещается.
В списке делают отметку о неудачном
введении токсина Шика, данный ребенок в разработке не учитывается.
Учет реакции проводят через 96 часов (на
4 сутки) после постановки реакции Шика. В отдельных случаях допускается
проведение учета и в более поздние сроки (на 5-6 день). Учет реакции Шика
проводят только при дневном освещении при рассеянном свете. Детей по списку
вызывают в наиболее благоприятное по освещенности место. Запрещается проводить
учет этой реакции у школьников, сидящих за партами.
Реакция Шика оценивается следующим
образом:
а) Реакция Шика положительная, если на
месте введения токсина
появляется кожная реакция в виде гиперемии и инфильтрата.
Степень реакции обозначается:
"+" если краснота в диаметре
1-1,5 см.
"++" если диаметр красноты
равен 1,5-3 см.
"+++" если он больше 3 см.
б) Реакция считается сомнительной (+/-),
если краснота и инфильтрат выражены неясно или размер инфильтрата не превышает
0,5 см. в диаметре.
Результаты реакции Шика обобщаются по
следующей форме:
Результаты реакции Шика
_______________________________(детское учреждение, школа)
__________________________________________________________________
_________________________ (населенный пункт) _____________________
___________________________ (область) ____________________________
токсин Шика серия ________________ срок годности _________________
______________________ контроль __________________________________
Реакция Шика проведена в период __________________________________
__________________________________________________________________
под руководством врача ___________________________________________
(фамилия и.о.)
средними мед. работниками ________________________________________
(фамилия и.о.)
|
Возраст |
Постановка |
Учтено |
В том числе
положительных |
||
|
всего |
из них по
интенсив- |
||||
|
абс. |
% |
+/- +
++ +++ |
|||
|
4-5 лет |
|
|
|
|
|
|
7-10 лет |
|
|
|
|
|
|
12-14 лет |
|
|
|
|
|
При анализе состояния иммунной прослойки
в очаге инфекции процент неиммунных состоит из лиц с положительной и
сомнительной реакциями к общему числу учтенных (а не поставленных) реакций.
После учета реакции Шика, детей со слабо
положительной (+) реакцией в кратчайший срок (1-2 дня) следует привить АДС-М
анатоксином однократно в дозе 0,5 мл; детей до 11 лет с интенсивно выраженной
положительной реакцией (++ или +++) - двукратно дозой 0,5 мл с интервалом в 30
дней: детей 12-14 лет, независимо от интенсивности реакции - однократно в дозе
0,5 мл.
Данные о результатах реакции Шика и
прививках по ее показаниям заносятся в карту профилактических прививок (форма N
63) и историю развития (форма N 112).
Учитывая, что на современном этапе
изменялась возрастная структура дифтерии в сторону увеличения старших
возрастных групп, в очагах инфекции следует проводить активную иммунизацию
подростков и взрослых.
Лиц в возрасте 15 лет и старше (без
ограничения возраста) с повышенным риском заражения в пределах очага: в
общежитии, по месту работы, учебы, контактировавших с больным дифтерией или
носителем токсигенных коринебактерий прививают (без предварительной постановки
реакции Шика) адсорбированным дифтерийно - столбнячным анатоксином с
уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М анатоксин) однократно в дозе 0,5 мл.
Санитарно - просветительная работа
Санитарное просвещение должно быть
направлено на разъяснение детям и их родителям, подросткам, персоналу,
педагогам о необходимости выполнения всех рекомендаций медицинских работников,
включающих своевременное обращение и госпитализацию больных дифтерией, с
подозрением на эту инфекцию, больных ангиной; направление соприкасающихся
больных для постановки реакции Шика: проведения прививок и т.д.
При этом должны быть использованы все
доступные методы: лекции, беседы в учреждениях и на дому, выступление по радио,
привлечение к санитарно - просветительной работе по дифтерии всех медицинских
работников.
Необходимо также широко использовать в
работе по ликвидации очага дифтерии санитарный актив.
После ликвидации очага дифтерийной
инфекции, необходимо в кратчайший срок проверить состояние активной иммунизации
с целью исправления недостатков на всех врачебных и фельдшерских участках
города и сельских районов данной административной территории.
Заместитель Министра
К.И.АКУЛОВ
Приложение N 3
к приказу Министерства
здравоохранения РСФСР
от 10.09.1982 г. N 575
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ
ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ
(МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ) <*>
В настоящих методических рекомендациях,
составленных в соответствии с действующими инструктивными материалами, особое
внимание обращено на правильность взятия и доставки материала в лаборатории,
обязательное применение комплекса тестов для идентификации микроорганизмов рода
коринебактерий, четкое соблюдение хода исследования (с использованием
бинокулярного стереоскопического микроскопа) для своевременной и правильной
выдачи ответа. Успех бактериологического исследования в значительной степени
зависит от чувствительности питательных сред к титрованному количеству
возбудителя, поэтому дается описание схемы бактериологического контроля
питательных сред и ингредиентов, рекомендуется определять содержание аминного
азота в питательных основах, средах, бульонах и т.д.
--------------------------------
<*> Составлены научными
сотрудниками Московского научно - исследовательского института эпидемиологии и
микробиологии имени Г.Н.Габричевского Минздрава РСФСР (к.м.н. Мазурова И.К.,
д.м.н. Бочкова В.А., к.м.н. Маргулис И.Л., Головина Н.М., Хац Ю.А., Пчелинцева
Т.Г. и бактериологом санэпидстанции г. Москвы, к.м.н. Сальникова Г.П.).
ОРГАНИЗАЦИОННО -
МЕТОДИЧЕСКАЯ РАБОТА
Бактериологические лаборатории
республиканских, краевых, областных и городских (в городах с районным делением)
СЭС являются методическим центром по бактериологической диагностике:
- организуют подготовку специалистов -
бактериологов с высшим и средним медицинским образованием, руководствуясь
"Программой семинара по бактериологической диагностике капельных инфекций"
МЗ РСФСР от 23.08.1977 N 06Б/7А-4788, с обязательным использованием дифтерийных
штаммов и постановкой контрольных задач;
- осуществляют контроль за работой
лабораторий по бактериологической диагностике дифтерийной инфекции в районах и
городах;
- контролируют правильность идентификации
штаммов коринебактерий дифтерии, полученных из лабораторий районов, городов;
- проводят бактериологический контроль и
контроль содержания аминного азота всех серий коммерческих питательных сред и
ингредиентов, снабжают ими районные лаборатории.
Баклаборатории городских и районных СЭС:
- организуют постоянное получение крови
для работы, используя местные ресурсы;
- обучают специалистов больниц и
поликлиник (терапевтов, оториноларингологов, инфекционистов, хирургов, медицинских
сестер процедурных кабинетов, инфекционных отделений и т.д.) правильному взятию
и посеву исследуемого материала.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ
Взятие и доставка материала
Учитывая в настоящее время значительно
меньшую обсемененность возбудителем даже при заболевании дифтерией, необходимо
обратить внимание на тщательное и правильное взятие материала для исследования.
Для взятия материала используют сухие
ватные тампоны, если посев будет произведен не позднее 2-3 часов после сбора
материала. Предварительно каждый тампон помещают в отдельную пробирку и
стерилизуют. Материал для исследования во всех случаях берут раздельными
тампонами одновременно из зева и носа, а при необходимости и из других мест
локализации патологического материала.
Слизь из зева берут натощак или не ранее
чем через 2 часа после еды; у лиц, леченных антибиотиками - не ранее чем через
3 дня после окончания лечения, чтобы исключить бактериостатическое действие
антибиотиков на возбудителя дифтерии. Язык фиксируют шпателем, при наличии
патологического процесса материал забирают на границе здоровой и больной ткани.
Пробирки четко маркируют, скрепляют
вместе от каждого лица и придают номер анализа. При проведении обследования
контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, в
поликлиниках или стационарах, когда посев будет произведен позже 2-3 часов от
момента взятия материала, рекомендуется засевать материал на чашки с
питательной средой, транспортировать в баклабораторию или помещать их в
термостат на сутки. При использовании в этих случаях полужидкой среды
обогащения материал следует забирать также сухим тампоном (на деревянной основе
или на проволоке из нержавеющего материала). Опускают тампон в пробирку со
средой обогащения и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Применение
среды обогащения удлиняет срок выдачи окончательного ответа на одни сутки.
Необходимо при транспортировке
предохранять питательные среды от замораживания.
В случае необходимости исследований на
коринебактерии дифтерии постмортально материал целесообразно брать только из
полости носа, с миндалин и гортани. Учитывая, что дифтерия является токсико -
септической инфекцией, нахождение возбудителя во внутренних органах крайне
редко в отличие от других септических заболеваний.
Тампоны необходимо отправлять в
лабораторию немедленно после взятия материала. Пробирки от одного лица (зев,
нос, кожа) скрепляют вместе. На каждой пробирке должен быть четко написан
порядковый номер анализа в соответствии с прилагаемым списком. На все взятые
анализы прилагается сопроводительный документ, где указывается фамилия и адрес
лиц, у которых взяты анализы, происхождение взятого материала (зев, нос),
название учреждения, направляющего материал, цель обследования
(диагностическая, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование и пр.).
ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ
Первый день
Предварительная бактериоскопия мазка с
тампона от больных делается только по требованию врача, направляющего анализ. С
этой целью материал берется двумя тампонами. Один из них используют для посева,
а другим делают несколько мазков на предметном стекле, поворачивая тампон всеми
его сторонами. Высохшие на воздухе мазки фиксируют трехкратным проведением
через пламя и окрашивают одной из следующих красок: щелочной метиленовой синью
Леффлера, уксуснокислой теллуидиновой синью, уксуснокислым кристалл - виолетом
или метил - виолетом.
Посев материала
Материал для исследования из зева с
миндалин, из носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность
одной из рекомендуемых плотных питательных сред в чашку Петри.
Посев от одного лица производят на одну
чашку, используя при этом одну половину поверхности среды для посева из зева с
миндалин, а вторую половину - для посева из носа.
При посеве материал втирают в среду со
всех сторон тампона на участке площадью 2 х 1 кв. см, а затем этим же тампоном
засевают штрихами по поверхности среды. Такой метод посева позволяет засеять
весь материал с тампона, получить изолированные колонии непосредственно с
чашки, чтобы работать с чистой культурой, что сокращает длительность анализа на
одни сутки. Засеянные чашки или пробирки со средой обогащения помещают в
термостат при 37 град. Высев из среды обогащения производят на следующие сутки
на плотные питательные среды тампоном, отжатым о стенки пробирки.
Второй день
Идентификация культуры
Очень важным обстоятельством при чашечном
методе исследования является значительное уменьшение объема работы практических
лабораторий. При массовых одномоментных обследованиях по эпидемиологическим
показаниям исключается необходимость изготовления, окраски и микроскопии
большого количества препаратов - мазков. Многолетний опыт исследователей и
практических работников привел к единому мнению, что только морфологические
признаки не являются достаточно надежным критерием для дифференциации
коринебактерий дифтерии от непатогенных представителей рода коринебактерий.
Колонии, выросшие на чашках,
просматривают через 24 часа после посева материала, а при отсутствии
подозрительных колоний чашки просматривают через 48 часов. Выросшие колонии
изучают с помощью стереомикроскопа (МБС-1, МБС-2, МБС-9), лупы или
невооруженным глазом.
Если через 48 часов не обнаруживают рост
микрофлоры на поверхности питательных сред, необходимо исследование материала
от лиц, обследованных с диагностической целью, произвести вторично.
Чашки с подозрительными колониями
отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопии
препаратов - мазков из подозрительных колоний можно не производить. На кровяно
- теллуритовых средах подозрительные колонии выглядят суховатыми серо - черного
цвета с приподнятым центром и изрезанными краями или более мелкими блестящими
колониями с ровными краями. На хинозольной среде Бучина подозрительные колонии
имеют синий цвет (с различными оттенками - от серовато - зеленоватого до
фиолетового), а среда на месте их роста приобретает, как правило, фиолетовый
оттенок. При просмотре чашек с помощью стереоскопического микроскопа
подозрительные колонии на кровяных теллуритовых средах через 24 часа светло -
серого цвета, а через 48 часов - серые с металлическим оттенком, с ровными или
изрезанными краями.
Из сомнительных колоний готовят препараты
- мазки. Морфологические признаки не позволяют установить видовую
принадлежность микроорганизма, но дают возможность предположительно отнести их
к роду коринебактерий. Представители этого рода являются полиморфными
палочками, располагающимися параллельно или под углом, с характерными
утолщениями на концах или без них, нередко с выраженными зернами волютина. Если
при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то
эти колонии подвергают дальнейшей идентификации по всем тестам.
Обнаружение в мазках чистых культур
кокков, дрожжей, споровых палочек и т.д. позволяет прекратить дальнейшее
изучение колоний.
Если выросли 1-2 колонии, то их
используют для посева одновременно (из каждой колонии) на 3 среды: одну
половину колонии засевают петлей (лучше работать с петлей диаметром 1,5 мм) на
среду для определения токсигенности, после чего петлю не обжигая погружают в
столбик среды для определения цистиназы (среда Пизу); вторую половину колонии
засевают в пробирку с сывороточным агаром для размножения чистой культуры и
дальнейшего изучения ее свойств.
Если вырастет только одна типичная, но
мелкая колония, необходимо ее пересеять в пробирку с сывороточным агаром для
размножения чистой культуры и дальнейшей идентификации. Не обжигая петли,
посеять уколом в столбик среды для определения цистиназы. При проведении
исследования с диагностической целью, если вырастет только одна, мелкая
колония, можно ее засеять на среду для определения токсигенности и не обжигая
петли - в столбик среды для определения цистиназы.
В случае роста большого количества
подозрительных изолированных однотипных колоний необходимо сразу же приступить
к изучению нескольких из них по ряду тестов идентификации (токсигенные
свойства, определение цистиназы, уреазы, сахаролитической активности).
Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем
посева одной половины каждой колонии на среду определения токсигенности и
необожженной петлей - на среду Пизу, а другой половины колонии - в пробирку с
сывороточным агаром для размножения и сохранения этой культуры. Учитывая, что в
исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные
разновидности коринебактерий дифтерии, рекомендуется при множественном росте
подозрительных колоний изучать токсигенные свойства по возможности у
максимального числа колоний.
Если на чашках нет изолированных колоний,
а наблюдается сплошной рост культуры и при микроскопии обнаруживают кокки или
другие микроорганизмы вместе с палочками, типичными для рода коринебактерий,
необходимо провести рассев на кровяно - теллуритовые или хинозольную среды для
получения изолированных колоний и дальнейшего изучения их свойств. Может быть
полезна постановка пробы на токсигенность, которую необходимо повторить с
чистой культурой.
Третий день (или четвертый)
Бактериологическое заключение. Сроки выдачи и
формулировка ответов
Через 24 часа при положительной пробе на
цистиназу, появлении специфических линий преципитаций на среде для определения
токсигенности (с учетом обнаружения характерных морфологических признаков)
изучаемая культура идентифицируется как токсигенные коринебактерии дифтерии.
При отсутствии специфических линий преципитации чашки с пробой на токсигенность
инкубируют еще 24 часа, а выросшую в пробирке на агаре с сывороткой культуру
(после определения ее чистоты) засевают на среды Гисса и ставят пробу на
уреазу. При отсутствии специфических линий преципитации (через 48 часов), но
при положительной пробе на цистиназу, глюкозу, отрицательной пробе на уреазу и
сахарозу культура идентифицируется как нетоксигенные коринебактерии дифтерии с
указанием биохимического типа. Расщепление сахарозы коринебактериями дифтерии -
явление крайне редкое. В таких случаях следует прежде всего думать о
загрязнении кокками и необходимо сделать рассев с сахарозы на одну из кровяно -
теллуритовых или хинозольную среды, а повторно выделенную культуру посеять на
среды Гисса.
При отсутствии специфических линий
преципитации, отрицательных пробах на цистиназу, сахарозу, глюкозу, крахмал и
положительную - на уреазу, культура идентифицируется как ложно - дифтерийные
коринебактерии (палочка Гофмана); при тех же отрицательных пробах, но при
разложении сахарозы и глюкозы и положительной пробе на уреазу культура
идентифицируется как дифтероид. В качестве одного из тестов идентификации
коринебактерий дифтерии может быть поставлена реакция агглютинации с
политиповой дифтерийной сывороткой.
СРОКИ ВЫДАЧИ И
ФОРМУЛИРОВКА ОТВЕТОВ
Предварительный ответ выдается при
исследовании материала из зева и носа у лиц, больных дифтерией, подозрительных
на заболевание дифтерией и у контактировавших с ними лиц. Он может быть выдан
немедленно, если по требованию лечащего врача производилась бактериоскопия
мазка с тампона. В этом случае ответы формулируются так: "При прямой
бактериоскопии мазка с тампона обнаружены палочки, подозрительные на
дифтерийные, исследование продолжается" или "При прямой
бактериоскопии мазка с тампона палочки, подозрительные на дифтерийные, не
обнаружены, исследование продолжается".
Предварительный ответ при обследовании
указанной категории лиц обязательно выдается бактериологом через 24-48 часов
после посева материала на чашки (в случае применения сред обогащения этот срок
может быть увеличен еще на 24 часа) на основании макроскопического и
микроскопического изучения выросших колоний и формулируется так: "В
посевах материала из зева (носа) обнаружены бактерии, подозрительные на
дифтерийные, исследование продолжается".
При отсутствии подозрительных колоний
выданный отрицательный ответ является окончательным.
При обследовании на бактерионосительство
с профилактической целью, а также при исследовании материала из мест редкой
локализации дифтерии предварительный ответ не выдается. В этих случаях выдается
только окончательный ответ, основанный на идентификации выделенных культур по
всем свойствам.
Окончательный ответ при обследовании лиц
всех категорий в случае обнаружения дифтерийных колоний в чашках Петри через 24
часа может быть выдан через 48 часов (культура токсигенная) или через 72 часа
(культура нетоксигенная). В тех случаях, когда колонии в чашках появляются
позднее чем через 24 часа, ответ выдается соответственно позднее.
Формулировка окончательного ответа при
положительном анализе: "Выделены токсигенные (или атоксигенные)
коринебактерии дифтерии". При изучении культурально - биохимических
признаков указывается принадлежность к типу гравис или митис.
В тех случаях, когда в предварительном
ответе указывается, что обнаружена дифтерийная палочка, а при последующем
изучении выделен дифтероид или другая микрофлора, окончательный ответ
формулируется так: "При дальнейшем исследовании обнаруженная палочка
оказалась не принадлежащей к виду коринебактерий дифтерии".
При необнаружении коринебактерий дифтерии
на плотных питательных средах выдается отрицательный ответ.
Во всех случаях обнаружения дифтерийных
микробов лаборатория обязана известить то учреждение, от которого послан анализ
и районного эпидемиолога.
При передаче ответа по телефону
необходимо записывать дату передачи и фамилии лиц, передавших и принявших
телефонограмму.
МЕТОДИКА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ НА ПЛОТНЫХ
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
В основе метода определения токсигенности
дифтерийных микробов ин витро лежит взаимодействие между токсином и
антитоксином, которое происходит на плотных питательных средах в местах
оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого микробами и
диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической
противодифтерийной сыворотке. В тех участках агара, где встречается токсин с
антитоксином, выпадает преципитат в виде белых линий, "стрел" или
"усов".
При определении токсигенности на плотной
питательной среде (in vitro) следует строго следить за плотностью среды,
установлением рН, режимом стерилизации, прозрачностью, точным соблюдением
целого ряда технических условий постановки пробы. При небольшом объеме работы
среду для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл
- количество, которое необходимо для приготовления одной чашки, а не во
флаконы. Последнее требует многократного расплавления агара, что может ухудшить
качество питательной среды. Необходимо помещать полоски фильтровальной бумаги
(1,5х8 см), смоченной 0,2-0,25 мл противодифтерийной антитоксической сывороткой
диаферм или ферментированным и очищенным специфической сорбцией дифтерийным
антитоксином (однозональной сывороткой), содержащих в этом объеме 100 - 120 МЕ,
на застывающую поверхность агара. Чашки со средой на токсигенность можно сохранять
в холодильнике (4 град.) одни сутки без фильтровальной бумаги. Культуру
засевают "бляшками" размером 0,7 см на таком же расстоянии между
"бляшками" и на расстоянии 0,5 см от фильтровальной бумаги. При
исследовании на токсигенность 1/2 колонии и смеси 2-6 колоний посев производят
двумя "бляшками" по обе стороны фильтровальной бумаги, при этом
следует всегда засевать с одной стороны фильтровальной бумаги по 1/2 колонии
(отдельных, изолированных), а с другой стороны - смеси колоний. На одну чашку
следует поглощать не более 10 "бляшек", при этом 6 "бляшек"
испытуемой культуры и 4 - контрольного штамма (см. схему).
При использовании в составе среды
антитоксической противодифтерийной сыворотки следует учитывать, что появление
преципитатов в агаровом геле у дифтерийный культур возможно не только за счет
взаимодействия токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и за счет
взаимодействия бактериальных антител с соответствующими антигенами микробной
клетки (неспецифические преципитаты).
Это зависит от того, что изготовляемые
сыворотки не являются в антигенном отношении моновалентными препаратами. Помимо
антител к дифтерийному экзотоксину, в них содержатся в различных количественных
соотношениях и антитела к микробному компоненту.
Неспецифические преципитаты могут
образовываться как у токсигенных, так и у нетоксигенных дифтерийных культур.
Эти преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, иногда
видимые только в лупу, появляются чаще через 48-72 часа, но у некоторых штаммов
- и на 1-е сутки.
Критерием оценки специфичности
преципитатов является расположение линий преципитации испытуемого штамма по
отношению к линиям контрольного (заведомо токсигенного штамма). В тех случаях,
когда у контрольного штамма появляется несколько линий преципитации,
специфическими следует считать наиболее четкие и наиболее рано появляющиеся
преципитаты. Наблюдаются следующие варианты в образовании преципитатов.
1. Испытуемая дифтерийная культура, у
которой образуются преципитаты, считается токсигенной, если эти линии
преципитации сливаются с соответствующими специфическими линиями заведомо
токсигенного штамма или идут на смыкание с ним (схема 1 - пример 14(1); 14(2);
14(3) и др.).
2. Испытуемая дифтерийная культура
считается нетоксигенной, если ее линии преципитации располагаются так, что
концы их не могут слиться с концами специфических линий контрольного штамма:
а) линии испытуемого штамма идут на
перекрест со специфическими линиями контрольного штамма (схема 3 - пример
20(2));
б) линии преципитации испытуемого штамма
перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими
линиями контрольного штамма (схема 3 - пример 20(1); 20(2);
в) линии преципитации испытуемого штамма
сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма (схема 2 - пример
15(3).
Иногда отмечается появление множественных
неспецифических линий преципитации.
В качестве контроля следует использовать
токсигенный штамм суточного или 2-суточного роста. Контрольный токсигенный
штамм всегда должен храниться в лаборатории. Его получают в Государственном НИИ
стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.
Л.А.Тарасевича, НИИВСах, НИИЭМах или в лабораториях городских и областных СЭС.
Нельзя применять производственный штамм Р-8 и его варианты. Хранить штамм
следует на сывороточном агаре при 4-10 град. (пересев каждые 14 дней) или на
полужидком агаре, приготовленном на мартеновском бульоне рН = 7,6, при
комнатной температуре (пересев один раз в три месяца). Штамм необходимо
периодически засевать на кровяной агар.
Для установления эпидемиологических
связей в очаге дифтерийной инфекции между спорадическими и групповыми
заболеваниями, а также выявления возможных случаев реинфекции целесообразно
использовать метод фаготипирования коринебактерий дифтерии, разработанный в
Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского МЗ РСФСР. С
целью установления фаговара санэпидстанции могут выслать выделенные штаммы
спецпочтой (на скошенном 10% сывороточном агаре в пробирках) в адрес института
(125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского).
Для определения серологического варианта
токсигенных коринебактерий дифтерии можно ставить развернутую реакцию
агглютинации с типовыми неадсорбированными дифтерийными агглютинирующими
сыворотками в соответствии с инструкцией по бактериологическому исследованию на
дифтерию.
Для дифференциации заболевания дифтерии
от носительства токсигенных коринебактерий дифтерии возможно применение
иммунологических методов исследования:
1. Определение титра антитоксина в
сыворотке крови по методу Иенсена (нейтрализация экзотоксина антитоксином в
коже кролика). Титры дифтерийного антитоксина в первые 3-5 дней заболевания
ниже или на уровне защитного (0,03 МЕ/мл) свидетельствует в пользу дифтерии,
титры 0,5 МЕ/мл и выше - против дифтерии.
2. Выявление антибактериальных антител по
реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием микробных антигенов
коринебактерий дифтерии. Диагностическое значение при заболевании дифтерией
имеет титр антибактериальных антител 1:80 и выше, а также нарастание титра в
сыворотке крови в динамике заболевания (не менее чем на 2 разведения).
Кровь при сомнительной клинической
картине заболевания забирают в первые дни и через 10-14 дней пребывания
больного в стационаре. Определение титра антитоксина в сыворотке крови может
иметь диагностическое значение только в первые дни заболевания до введения
антитоксической сыворотки, на титры антимикробных антител последняя не влияет.
Сыворотки крови следует присылать в запаянных ампулах для постановки
иммунологических диагностических тестов в Московский НИИ эпидемиологии и
микробиологии им. Г.Н.Габричевского Минздрава РСФСР по адресу, указанному выше.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Качество питательной среды является
важнейшим условием при любом бактериологическом исследовании. Если добиваться
максимальной всхожести и высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого
материала, то необходимо создать оптимальные условия для роста и размножения
этих бактерий, сохранения их биологических свойств и создания условий для
ингибиции сопутствующей флоры.
В настоящее время в качестве основ для
питательных сред используют сухие питательные агары Дагестанского НИИ
питательных сред. Однако некоторые серии этих агаров нестандартны и нередко
бывают непригодны для культивирования коринебактерий дифтерии.
Для улучшения качества питательных сред
(повышения всхожести и высеваемости) следует использовать для растворения
сухого агара или сухой среды Бучина вместо дистиллированной воды перевар
Хоттингера, 1% пептонную воду или продукты рыбного происхождения (рыбная
паста), выпускаемые Дагестанским НИИ питательных сред (разводится по прописи).
Отечественная промышленность изготавливает для нужд лечебной медицины
аминопептид, который представляет собой ферментативный гидролизат крови
животных и содержит полноценный набор аминокислот и простейших пептидов.
Аминопептид выпускается в стерильном виде в стеклянных флаконах по 450 мл.
Препарат изготавливается в соответствии с требованиями фармакопейной статьи (ФС
42-630-72), что обеспечивает его высокую стандартность. По истечении срока
годности препарат не используется по прямому назначению и подлежит уничтожению.
Целесообразно использовать аминопептид с истекшим сроком годности как основу
питательных сред для культивирования и выделения коринебактерий дифтерии, что
будет способствовать стандартизации и улучшению качества сред, сократит
расходование дефицитного пищевого сырья и обеспечит определенный экономический
эффект. Аминопептид можно использовать для изготовления питательных сред по
истечении срока годности в течение 2-х лет. Приобретение может быть
осуществлено в аптечной сети, хирургических стационарах и станциях переливания
крови.
Многолетний практический опыт показал,
что при бактериологическом исследовании на дифтерию лучшими являются кровяно -
теллуритовые среды. Основным ингредиентом питательных сред является кровь в
количестве 10-15 мл на 100 мл агара. Если для приготовления питательных сред
использовали аминопептид, то крови требуется в 2-3 раза меньшем количестве
(5%). Использование сыворотки лошади или крупного рогатого скота снижает
высеваемость коринебактерий дифтерии в 2,5-4 раза. Не следует применять и
цитратную кровь. Используют дефибринированную кровь скота (крупного рогатого скота,
лошадей, свиней, овец), полученную на бойне, дефибринированную кровь
лабораторных животных (кроликов), плацентарную кровь и сгустки после
отрицательных серологических реакций. Сгустки собирают в стерильные бутыли со
стеклянными бусами и разбивают их. В случае, когда не удается разбить бусами,
сгустки замораживают и оттаивают (бутыль со сгустками помещают на сутки в
морозильную камеру, после чего они легко разрушаются). Затем добавляют
стерильный физиологический раствор 1/5-1/4 объема сгустков. Для лучшего
сохранения крови (дефибрированной и сгустков после их разрушения) в 14-16 мл
добавляют 1 мл 2% раствора теллурита калия. Смесь крови с теллуритом калия
можно сохранять в холодильнике до 2 месяцев. При приготовлении среды на каждые
100 мл растопленного питательного агара количество теллурита калия уменьшают на
1 мл, учитывая, что этот ингредиент был добавлен для консервирования крови.
В переваре Хоттингера, бульонах из рыбной
пасты и др. должно содержаться аминного азота до 100-150 мг %; в готовых основах
приготовления кровяно - теллуритовой среды, в среде Бучина (2% агаровых средах)
- до 200 мг%, в среде Клауберг П (3% агаровой среде) - до 300 мг%. Лучше
определять аминный азот в 1% агаровых основах, которые предварительно
расплавляют, а дистиллированную воду подогревают в водяной бане. Если
питательная агаровая основа готовится на стандартном препарате - аминопептиде,
содержащем всегда постоянное количество аминного азота, определение данного
показателя не требуется.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА
Реактивы
1. Формалин - 40% (продажный без осадка).
2. Фенолфталеин (1% водно - спиртовой
раствор в соотношении 1:1).
3. Бромтимоловый синий.
4. NaOH 0,1 N (приготовленный из
фиксанала).
5. HCl 0,1 N (приготовленный из
фиксанала).
Приготовление формольной смеси
К 100 мл формалина добавляют 2 мл
раствора фенолфталеина и подщелачивают 0,1 N раствором едкого натра, добавляя
его каплями до появления стойкого слабо - розового окрашивания. В случае
выпадения белого осадка смесь к употреблению не пригодна.
Приготовление раствора бромтимолового синего
Бромтимоловый синий в количестве 0,1 г
растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 0,1 N раствор едкого натра
(примерно от 0,3 до 16 мл) до тех пор, пока раствор не приобретает цвета
бутылочного стекла, и доводят объем дистиллированной водой до 250 мл.
Приготовление буферной смеси рН = 9,1
Смешивают 27 мл децинормального раствора
буры (раствор 12,404 г борной кислоты в 1 л децинормального едкого натра) с 3
мл децинормального раствора соляной кислоты и 6 мл 0,1% раствора фенолфталеина
(водно - спиртового в соотношении 1:1).
Ход определения
В два узких высоких стаканчика с плоским
дном объемом в 50 мл наливают 2 мл испытуемого раствора и 18 мл
дистиллированной воды. В третий стаканчик наливают 20 мл буферной смеси. В
первый стаканчик добавляют 3-5 капель раствора индикатора - бромтимолового
синего. Если испытуемый раствор имеет щелочную реакцию (при добавлении
бромтимолового синего он окрашивается в синий цвет), то его титруют децинормальным
раствором соляной кислоты до цвета бутылочного стекла и отмечают количество
соляной кислоты (в мл), израсходованное на титрование (А1). Если исследуемый
раствор имеет кислую реакцию (при добавлении бромтимолового синего он
окрашивается в желтый цвет), то его титруют децинормальным раствором едкого
натра до цвета бутылочного стекла и отмечают количество раствора щелочи (в мл),
израсходованное на титрование (А2).
Во второй стаканчик добавляют 2,5 мл
формольной взвеси и титруют децинормальным раствором едкого натра до малинового
цвета, аналогичного цвету буферной смеси, налитой в третий стаканчик.
Учитывается количество децинормального раствора щелочи (в мл) израсходованное
на титрование (В).
Количество аминного азота (NH2)
вычисляется по следующей формуле:
С х 1,4 х К х 100
NH2 (в мг%) = -----------------
Н
Величину С рассчитывают следующим
образом: при щелочной реакции исследуемого раствора С = А1 + В; при кислой
реакции С = В - А2;
К - поправка децинормального раствора
NaOH при приготовлении из фиксанала равна 1;
1,4 - количество аминного азота (в мг),
соответствующее 1 мл децинормального раствора едкого натра;
Н - количество исследуемого раствора.
СРЕДЫ ДЛЯ
ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА МАТЕРИАЛА
1. Среда Клауберг П
К 100 мл 3% питательного агара рН = 7,6,
содержащего аминного азота 300 мг% (7,5 г сухого питательного агара или агара
"Д" на 100 мл различных бульонов или дистиллированной воды),
расплавленного и охлажденного до 50 град., добавляют 3 мл 2% раствора теллурита
калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл "лаковой" крови.
Приготовление глицериновой смеси. К 40 мл
дефибринированной крови или разбитых в физиологическом растворе сгустков добавить
20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуется при
температуре 110 град. в течение 30 мин.). Если используемая кровь или сгустки
были нестерильны, то глицериновая смесь сохраняется в холодильнике при
температуре от 4 до 10 град. в течение 3-6 недель.
Приготовление "лаковой" крови.
К 34 мл стерильной дистиллированной воды добавить 26 мл дефибринированной крови
или разбитых в физиологическом растворе сгустков.
2. Кровяной теллуритовый агар
К 100 мл 2% питательного агара рН = 7,6,
содержащего аминного азота 200 мг% (5 г сухого питательного агара или агара
"Д" на 100 мл вышеописанного любого бульона или дистиллированной
воды), расплавленного и охлажденного до 50 град., добавляют 2 мл 2% раствора
теллурита калия и 15 мл гемолизированной крови.
Приготовление гемолизированной крови
К 10 мл дефибринированной крови добавить
5 мл стерильной дистиллированной воды (объем гемолизированной крови на 100 мл
питательного агара). Гемолизированную кровь можно получить также путем
вымывания гемоглобина из сгустков крови. Для этого к разбитым в физиологическом
растворе сгусткам добавляют 1/3 объема дистиллированной воды. На 100 мл
питательного агара добавляют 15-20 мл этой смеси.
3. Сухая хинозольная индикаторная среда Бучина
К 100 мл дистиллированной воды или
бульона Хоттингера или 1% пептонной воды добавляют 7-9 г (согласно прописи на
этикетке) порошка сухой хинозольной среды, тщательно размешивают и нагревают на
слабом огне до полного растворения агара. Среду кипятят в течение 2-3 минут, не
допуская пригорания агара, до образования крупнопузырчатой, быстро оседающей
пены. К охлажденной до 50 град. среде добавляют 10-15 мл стерильной
дефибринированной крови.
4. Кровяной теллуритовый агар на аминопептиде
К 100 мл 2% питательной агаровой основы
(вариант I или II) рН = 7,6, содержащего аминного азота 140 мг%, расплавленного
и охлажденного до 50 град. C, добавляют 2 мл 2% раствора теллурита калия и 5 мл
дефибринированной или гемолизированной крови.
5. Среда Клауберг II на аминопептиде
К 100 мл 3% питательной агаровой основы
(вариант 1 или 2) рН = 7,6, содержащей 200 мг% аминного азота, расплавленной и
охлажденной до 50 град. C, добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл
глицериновой смеси и 50 мл "лаковой" крови.
Состав и приготовление питательных агаровых основ
на аминопептиде
Для приготовления кровяных теллуритовых
сред рекомендуется использовать два варианта питательных агаровых основ:
Вариант I - состав агаровой основы для кровяной
теллуритовой
среды (расчет на 1 литр)
1. Аминопептид 1 объем
2. Дистиллированная вода 3 объема
3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) 5,0 г
4. Натрий хлористый (NaCl) 4,0 г
5. Агар 20,0 г
6. Л-цистин гидрохлорид (солянокислый) 0,01 г
(1% раствор 1 мл)
Вариант I - состав агаровой основы для среды Клауберг II
(расчет на 1 литр)
1. Аминопептид 1 объем
2. Дистиллированная вода 2 объема
3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) 5,0 г
4. Натрий хлористый (NaCl) 4,0 г
5. Агар 30,0 г
6. Л-цистин гидрохлорид (солянокислый) 0,01 г
(1% раствор - 1 мл)
Приготовление питательных агаровых основ для
кровяной теллуритовой среды и среды Клауберг II
Аминопептид разводят дистиллированной
водой, добавляют хлористый натрий (NaCl) и агар, кипятят до расплавления.
Добавляют ЭКД, размешивают до его полного растворения, устанавливают рН =
7,8-7,9 20% раствором едкого натра (NaOH) и кипятят 5 мин. Фильтруют через
ватно - марлевый фильтр, доводят до первоначального объема горячей
дистиллированной водой, добавляют необходимое количество 1% раствора цистина. В
случае отсутствия цистина гидрохлорида, хорошо растворимого в воде, можно
использовать Л-цистин, растворимый в 0,1 N растворе едкого натра (NaOH).
Вариант 2 питательных агаровых основ для
кровяной теллуритовой среды и среды Клауберг II готовится так же, как и вариант
1, но с добавлением активированного угля из расчета 3,0 г на литр питательной
агаровой основы. Уголь добавляют одновременно с цистином.
Питательные агаровые основы (вариант 1 и
2) разливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110-112 град. C (0,5 атм.)
в течение 30 мин. с предварительным прогревом текучим паром при 100 град. C.
Сохраняются питательные агаровые основы в
холодильнике в течение 2-х месяцев.
Все питательные среды разливают по чашкам
Петри слоем 3 - 4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии
хранения при Т от 4 до 10 град. Для выделения и размножения чистой культуры
используют вместо свернутой сыворотки скошенный в пробирках агар с добавлением
20-30% сыворотки лошади или крупного рогатого скота.
СРЕДЫ ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ
1. Приготовление мартеновского агара с мясной
водой
двойной концентрации
Приготовление мартеновского пептона.
Свиные желудки, желательно парные, с упругими стенками, большим количеством
слизи и без катаральных явлений очищают от жира (желудки, пропитанные желчью,
отбрасывают), разрезают и измельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков
помещают в бутыли емкостью 3-5 л и заливают подогретой до 40-50 град.
водопроводной водой из расчета на один литр воды 300-350 г измельченной массы.
Температура должна быть 40 град. Туда же прибавляют 1% химически чистой соляной
кислоты (уд. вес 1,19). Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат при
температуре 45-48 град. на 48 часов (не более), не закрывая бутыль пробкой. В
течение процесса переваривания бутыль встряхивают, вначале чаще (через 1-1,5
часа), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутыли лежит небольшой
слой темного осадка.
Полноту осаждения балластных белков можно
проверить путем добавлении к 5 мл профильтрованного пептона 1-2 капли 10% NaOH.
Муть не должна появляться.
Действие фермента останавливают
нагреванием в водяной бане, постепенно доводя температуру до 80 град.,
устанавливаемую по показанию термометра, погруженного в бутыль с переваром.
Нагревание продолжается в течение 10 минут. Бутыли тщательно взбалтывают,
закрывают пробкой и ставят в прохладное, сухое помещение для отстаивания при
температуре не выше 12 град. Пептон годен к употреблению не ранее чем через 7
дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.
Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1
л пептона для консервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком виде
может храниться без стерилизации при комнатной температуре.
Приготовление мясной воды. Для
приготовления мясной воды желательно пользоваться свежим незамороженным мясом
средней упитанности нестарого животного. Обезжиренное, освобожденное от
сухожилий мясо пропускают через мясорубку, заливают водой в пропорции 1 л воды
на 1 кг фарша и оставляют на ночь в холодильнике (от 4 до 10 град.), утром
смесь кипятят на асбестовой сетке в течение 15-20 минут с момента закипания.
Готовый настой фильтруют, фарш отжимают, полученную мясную воду разливают в
стерильные бутыли по 250-500 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30
минут. Хранить по возможности в холодильнике.
Приготовление питательного агара.
Мартеновский пептон - 0,5 л, мясная вода - 0,5 л, агар - агар - 15-18 г
(1,5-1,8%), уксуснокислый натрий - 5 г, мальтоза - 3 г.
15 или 18 г агара промывают в течение
рабочего дня в проточной водопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1
л мартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 л мясной воды).
Устанавливают рН = 7,8-8,0 путем подщелачивания бульона, 20% раствором NaOH по
бумажке с индикатором крезоловый красный, которая при этой реакции изменяет
желтый цвет в розово - малиновый. Бульон кипятят в течение 10 минут, считая с
момента закипания, затем добавляют 0,5% (5 г на 1 л) уксуснокислого натрия,
0,3% мальтозы (3 г на 1 л), проверяют рН и, если нужно, снова доводят до 7,8-8,0,
кипятят в течение 15 минут, дают отстояться в теплом месте (в аппарате Коха,
термостате) 2-3 часа и фильтруют через тканевый или ватно - марлевый фильтр.
Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) при большом объеме работы или
пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 мин.
Перед разливкой в чашки Петри к
растопленному и охлажденному до 50 град. питательному 1,5% агару добавляют 20%
нормальной лошадиной сыворотки или к 1,8% агара 30% сыворотки крупного рогатого
скота. Сыворотка не должна содержать даже следов гемолиза, т.к. это задерживает
токсинообразование.
Приготовление бумажек с индикатором крезоловый
красный
0,1 г крезолового красного растворяют в
100 мл 95% спирта и оставляют при температуре 37 град. на 24 часа, часто
встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной
бумаги и быстро высушивают. Ярко - желтый цвет бумажек в щелочной среде
переходит в разные оттенки красного.
2. Сухой питательный агар, выпускаемый
Дагестанским
НИИ питательных сред, для определения
токсигенности
дифтерийных микробов
Для приготовления среды сухой порошок
растворяют в воде из расчета 3 г на 100 мл, тщательно размешивают на слабом
огне при постоянном помешивании, нагревают до полного расплавления агара,
кипятят в течение 5-7 минут с закрытой ватной пробкой, фильтруют через ватно -
марлевый или тканевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) или
пробирки (10 мл), стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут.
Перед разливкой в чашки Петри к растопленной и охлажденной до 50 град. среде
добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или 30% сыворотки крупного
рогатого скота.
Среда Пизу для определения фермента цистиназы
К 90 мл расплавленного 1,5%, только
мартеновского агара (не допускается использование агара Хоттингера), рН = 7,6,
добавляют 2 мл 1% раствора цистина, приготовленного на 0,1 растворе H2SO4 (или
0,1 N HCl), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 N раствора
NaOH. Раствор NaOH добавляют к среде для нейтрализации соответствующего
количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны быть взаимно оттитрованы,
можно использовать фиксаналы, выпускаемые предприятиями химической
промышленности. Среду стерилизуют при температуре 112 град. в течение 30 минут,
можно хранить один месяц.
К расплавленной (для сохранения цистина
агар с цистином при расплавлении не следует кипятить) и охлажденный до 40-45
град. среде добавляют 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца. Раствор
уксуснокислого свинца приготовляют extemporae, используя стерильную пробирку и
стерильную дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане
при 80-90 град. в течение 20-30 минут, перемешивают со средой, добавляют 9 мл
лошадиной или бычьей сыворотки (сыворотка в присутствии уксуснокислого свинца
свертывается при 50 град. и среда приобретает молочный цвет, что затрудняет
учет реакции - появление "облачка", поэтому следует охлаждать до
40-45 град.). Среду стерильно разливают по пробиркам любого диаметра столбиком
высотой 3-4 см. Посев производят уколом.
При росте дифтерийные бактерии благодаря
ферменту цистиназе расщепляют цистин. Образующийся при этом сероводород
вступает в реакцию с имеющимся в среде уксуснокислым свинцом, в результате чего
последний переходит в сернистый свинец - соединение темно - коричневого цвета.
При посеве уколом коринебактерии дифтерии образуют интенсивное потемнение по
ходу укола и вокруг него и характерное "облачко" темно - коричневого
цвета на расстоянии 1 см от поверхности. Ложнодифтерийные бактерии и
дифтероиды, как правило, не вызывают никаких изменений среды или дают слабое
потемнение по ходу укола, никогда не сопровождающееся "облачком".
Результаты учитываются с момента посева через 20-24 часа.
Все другие среды для определения
биохимических свойств (ферментов уреазы, сахаролитических) готовятся в строгом
соответствии с прописями инструкции по бактериологическому исследованию на
дифтерию от 1967 г. N 690-67 или приложение N 4 к приказу Минздрава СССР от
1974 г. N 580.
Контроль питательных сред
Ввиду нестандартности питательных основ и
ингредиентов, используемых при приготовлении сред для исследований при
дифтерии, каждые новые серии сухих агаров Дагестанского научно -
исследовательского института питательных сред (агар "Д", хинозольный
агар Бучина, другие питательные агары, сухой питательный агар для определения
токсигенности, продукты рыбного происхождения и др.), питательные среды,
приготовленные в лаборатории (мартеновский, мясо - пептонный агар и агар на
переваре мяса по Хоттингеру), среды для определения биохимических свойств и
новые ингредиенты подлежат бактериологическому контролю.
1. Качество питательной среды (или
питательной основы) устанавливают путем определения: а) всхожести дифтерийных
бактерий (контрольного музейного или свежевыделенного токсигенного штаммов); б)
ингибирующих свойств в отношении сопутствующей флоры (стафилококка). Готовят 4
чашки Петри с испытуемой средой и в 7 стерильных пробирках делают
последовательные разведения суточной культуры коринебактерий дифтерии, а также
стафилококка. Используют стандарт мутности (по кишечной палочке).
Схема приготовления разведений культуры
коринебактерий дифтерии и стафилококка
┌────────┬─────────────────┬──────────────────────┬──────────────┐
│ NN │ Количество │ Объем вносимой │ Количество │
│пробирок│физиологического │ культуры (в мл) │ микробов │
│ │раствора (в мл) │ │ в 1 мл │
├────────┴─────────────────┴──────────────────────┴──────────────┤
│ Исходное разведение 1 млрд микробных тел в 1 мл │
│ физиологического раствора │
├────────┬─────────────────┬──────────────────────┬──────────────┤
│ │ │ │ 1 000 000 000│
│ 1. │ 1,0 │ 1,0 исходной взвеси │ 500 000 000│
│ 2. │ 0,9 │ 0,1 из 1-й пробирки │ 50 000 000│
│ 3. │ 0,9 │ 0,1 из 2-й -"- │ 5 000 000│
│ 4. │ 0,9 │ 0,1 из 3-й -"- │ 500 000│
│ 5. │ 0,9 │ 0,1 из 4-й -"- │ 50 000│
│ 6. │ 0,9 │ 0,1 из 5-й -"- │ 5 000│
│ 7. │ 0,4 │ 0,1 из 6-й -"- │ 1 000│
└────────┴─────────────────┴──────────────────────┴──────────────┘
На две чашки с испытуемой средой делают
высев дифтерийной культуры только из 6-го и 7-го разведений, внося на каждую
чашку по 0,1 мл взвеси 6-го и 7-го разведений (500 и 100 микробных клеток
соответственно), досуха растирают шпателем. Так же засевают 6-е и 7-е
разведения стафилококка.
Учет производят через 24 и 48 часов.
Среда или питательная основа признаются годными к применению при следующих
условиях: культура коринебактерий дифтерии должна дать рост в виде отдельных
колоний через 24 часа инкубации при посеве 6-го разведения и даже одной колонии
из 7-го разведения, при отсутствии в 6-м и 7-м разведениях роста стафилококка.
2. Подвергаются испытанию среды для
определения токсигенности коринебактерий дифтерии и новые ингредиенты
(антитоксическая противодифтерийная сыворотка, лошадиная сыворотка, сыворотка
крупного рогатого скота и т.д.).
Данный контроль осуществляется путем
приготовления среды для определения токсигенности и испытания ее контрольным
токсигенным дифтерийным штаммом, соблюдая все этапы методики определения
токсигенных свойств на плотных питательных средах. Пригодными для работы
считаются те серии среды, при использовании которых у токсигенного контрольного
штамма интенсивные преципитаты образуются через 24 часа после посева
"бляшками". Среды (или новые ингредиенты) не могут быть использованы
и подлежат замене в случае отсутствия преципитатов или появления их в более
поздние сроки.
3. Бактериологический контроль проходят
среды для определения биохимических свойств. В среду Пизу, бульон с мочевиной
(или реактивы А и В), среды Гисса засевают петлей контрольный дифтерийный
штамм; при проверке сред Гисса контрольный дифтерийный штамм должен быть
биохимического типа гравис.
Заместитель Министра
К.И.АКУЛОВ
Приложение 1
Формы регистрационных журналов
Форма регистрации поступающего в лабораторию
материала
на бактериологическое исследование по дифтерии
|
NN |
Дата |
Ф., И., О. |
Воз- |
Из какого |
Повод |
Отку- |
Питательные |
Даты |
Бактериоло- |
|||
|
пред- |
зак- |
|||||||||||
|
24 |
48 |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Примечание. В графе "Питательные
среды" указать наличие роста, описать морфологию подозрительных колоний,
при необходимости морфологию культуры, если производилась микроскопия.
Форма регистрации результатов исследований
с подробным описанием хода исследования и
дифференциально - диагностических признаков
культуры
|
NN |
NN анали- |
Дата |
Ф., И., О. |
Воз- |
Повод к |
Отку- |
Токсиген- |
Цис- |
Разложение |
Уре- |
Дата |
Бакте- |
|||
|
24 |
48 |
са- |
глю- |
крах- |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Форма учета контроля питательных основ,
ингредиентов и сред
|
Дата |
Что исследовано |
N серии и |
Рост диф- |
Подавление |
Среды Гисса |
Заключение |
||
|
|
24 |
48 |
24 |
48 |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Приложение 2
Сопроводительные документы при
пересылке исследуемого материала
Характеристика штаммов, для фаго- и
серотипирования
|
NN |
Ф., И., О. |
Воз- |
Повод |
Батериологическое |
Фаго- |
Серо- |
|||||
|
токси- |
цис- |
уре- |
разложение |
||||||||
|
крах- |
саха- |
глю- |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Примечание. Высылается в 2 экземплярах,
последние две графы заполняет МНИИЭМ при ответе.
Данные, присылаемые к сыворотке крови
|
Ф., И., О. |
Воз- |
Клини- |
Дата |
Дата |
Бактерио- |
Приви- |
Краткое |
|
|
|
|
|
|
|
|
|