|
Номер смеси |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
Хлороформ, объем
исходного |
0,01 |
0,05 |
0,10 |
0,50 |
1,00 |
2,00 |
|
Концентрация
хлороформа, |
0,002 |
0,0104 |
0,021 |
0,1 |
0,215 |
0,42 |
|
Тетрахлорметан,
объем |
0,01 |
0,05 |
0,10 |
0,15 |
0,20 |
0,25 |
|
Концентрация
тетрахлорметана, |
0,0001 |
0,0005 |
0,0010 |
0,0015 |
0,0020 |
0,0025 |
|
1,2-Дихлорэтан,
объем |
0,2 |
0,5 |
1,0 |
2,0 |
5,0 |
10,0 |
|
Концентрация
1,2-дихлорэтана, |
0,025 |
0,063 |
0,126 |
0,25 |
0,63 |
1,26 |
|
Хлорбензол, объем
исходного |
0,05 |
0,10 |
0,15 |
0,20 |
0,50 |
1,00 |
|
Концентрация
хлорбензола, |
0,011 |
0,022 |
0,033 |
0,044 |
0,110 |
0,220 |
Приготовленный аттестованный раствор
помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя
- хлорида натрия, подщелачивают 30%-м раствором гидроксида натрия до достижения
рН 8-10 и экстрагируют 10 куб. см диэтилового эфира. Содержимое воронки
интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в
пробирку. Далее пробу центрифугируют при 7000 об./мин. в течение 10 мин. для денатурации белка. В
хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 куб. мм экстракта
каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:
температура термостата колонок - 90 град. С;
температура испарителя - 170 град. С;
температура детектора - 250 град. С;
расход газа-носителя (азот) - 30 куб. см/мин.;
скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч;
время удерживания хлороформа - 3 мин. 05 с;
тетрахлорметана - 4 мин. 20 с;
1,2-дихлорэтана - 6 мин.;
хлорбензола - 15 мин.
На полученной хроматограмме определяют
площади пиков определяемых компонентов и по средним результатам из 6 серий
строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в квартал и
при смене партии реактивов.
7.5. Отбор проб
Отбор проб венозной крови в объеме не менее
10 куб. см производится в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой
пробкой, в которую предварительно добавлено 0,1 куб. см раствора гепарина.
Анализ крови проводить сразу или хранить в морозильной камере не более 5 дней.
8. Выполнение измерений
Пробу крови в объеме 2 куб. см доводят до
50 куб. см бидистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250
куб. см, добавляют 30 г высаливателя - хлорида натрия, подщелачивают 30%-м
раствором гидроксида натрия до достижения рН 8-10 и экстрагируют 10 куб. см
диэтилового эфира. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после
отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку. Далее пробу центрифугируют при
7000 об./мин. в течение 10
мин. для денатурации белка. После отстаивания эфирный экстракт сливают в другую
пробирку. Полученный центрифугат в объеме 10 куб. мм хроматографируют и
проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленной
пробе по калибровочному графику. Процедуру повторяют аналогично для второго образца
и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови. Условия
выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной
характеристики (п. 7.4.).
9. Вычисление
результатов измерений
На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной
характеристике определяют концентрацию алифатических хлорированных
углеводородов и хлорбензола в крови. За результат измерения принимают
среднее арифметическое значение двух параллельных определений Х , Х ,
max min
расхождение между которыми не должно превышать значения предела
повторяемости r (табл. 3). Концентрации хлорированных углеводородов
n
рассчитывают по формуле:
А х V
экст.
Х = ----------,
V х V
1 2
где:
А - количество компонента, найденное по калибровочному графику, мкг;
V - объем экстрагента, куб. см;
экст.
V - объем экстрагируемой крови, куб. см;
1
V - объем хроматографируемой пробы, куб. см.
2
_
Результат измерений представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см, где
Х + Х
_ _ max min
Х - средний результат анализа, мкг/куб. см, Х = -----------, при условии:
2
r Х + Х
n max min
Х - Х <= --- х -----------,
max min 100 2
где:
Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений;
max
Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений;
min
r - значение предела повторяемости, %;
n
ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:
_
дельта х Х
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где дельта - относительное значение характеристики погрешности, %.
10. Внутренний
контроль качества
Внутренний контроль качества (ВКК) измерений
- повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость),
точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве
измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в
соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний
контроль качества результатов количественного химического анализа".
Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с
погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.
Таблица 2
ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
ТОЧНОСТИ,
ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
┌────────────────┬─────────────────┬────────────────────┬─────────────────┐
│ Наименование │Показатель │ Показатель │ Показатель │
│ определяемого │повторяемости │ воспроизводимости │точности (границы│
│ компонента и │(относительное │ (относительное │ относительной │
│ диапазон │среднеквадрати- │среднеквадратическое│ погрешности при │
│ измерений, │ческое отклонение│ отклонение │ вероятности │
│ мкг/см │повторяемости), │ воспроизводимости) │ Р = 0,95), │
│ │дельта , % │ дельта , % │ +/- дельта, % │
│ │ r │ R │ │
│ │ │ _ │ │
│ │ │ Хl │ │
├────────────────┼─────────────────┼────────────────────┼─────────────────┤
│Хлороформ, │ 8,4 │ 10,5 │ 34,8 │
│от 0,002 │ │ │ │
│до 0,420 вкл. │ │ │ │
├────────────────┼─────────────────┼────────────────────┼─────────────────┤
│Тетрахлорметан, │ 15,7 │ 18,0 │ 19,1 │
│от 0,0001 │ │ │ │
│до 0,0030 вкл. │ │ │ │
├────────────────┼─────────────────┼────────────────────┼─────────────────┤
│1,2-Дихлорэтан, │ 3,7 │ 12,1 │ 16,0 │
│от 0,025 │ │ │ │
│до 1,300 вкл. │ │ │ │
├────────────────┼─────────────────┼────────────────────┼─────────────────┤
│Хлорбензол, │ 4,4 │ 12,5 │ 15,4 │
│от 0,011 │ │ │ │
│до 0,200 вкл. │ │ │ │
└────────────────┴─────────────────┴────────────────────┴─────────────────┘
Таблица 3
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И
ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р
= 0,95
┌────────────────┬─────────────────────────┬──────────────────────────────┐
│ Наименование │ Предел повторяемости │ Предел внутрилабораторной │
│ определяемого │ (относительное значение │ воспроизводимости │
│ компонента и │допускаемого расхождения │ (относительное значение │
│ диапазон │между двумя результатами │допускаемого расхождения между│
│ измерений, │ параллельных │двумя результатами измерений, │
│ мкг/куб. см │ определений), r , % │ полученными в одной │
│ │ n │ лаборатории, но в разных │
│ │ │ условиях), R , % │
│ │ │ _ │
│ │ │ Хl │
├────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────────────────┤
│Хлороформ, │ 13,3 │ 29,0 │
│от 0,002 │ │ │
│до 0,420 вкл. │ │ │
├────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────────────────┤
│Тетрахлорметан, │ 13,5 │ 22,3 │
│от 0,0001 │ │ │
│до 0,0030 вкл. │ │ │
├────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────────────────┤
│1,2-Дихлорэтан, │ 10,2 │ 15,8 │
│от 0,025 │ │ │
│до 1,300 вкл. │ │ │
├────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────────────────┤
│Хлорбензол, │ 12,2 │ 16,9 │
│от 0,011 │ │ │
│до 0,200 вкл. │ │ │
└────────────────┴─────────────────────────┴──────────────────────────────┘
10.1. Контроль
стабильности градуировочного графика
Контроль стабильности градуировочного
графика проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют
содержание исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые
соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка
признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением
концентраций не превышает 5%.
10.2. Контроль
повторяемости
Относительное расхождение между результатами двух измерений,
выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении
образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же
средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала
времени, не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).
n
Повторяемость результатов параллельных измерений признают
удовлетворительной, если:
Х + Х
n max min
Х - Х <= --- х -----------,
max min 100 2
где:
r - значение предела повторяемости, %;
n
Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений;
max
Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений.
min
Если условие не выполняется, эксперимент
повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины,
приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
10.3. Контроль
воспроизводимости
Внутренний контроль воспроизводимости
проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и
анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения
анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа,
разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных
измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:
_ _
R Х + Х
_ 1 2
_ _ Хl
|Х - Х | <= --- х -------,
1 2 100 2
где:
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных
1
измерений, мкг/куб. см;
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных
2
измерений, полученный в других условиях, мкг/куб. см;
R - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % (табл.
_
Хl
3).
_ _
Расхождение между результатами измерений Х и Х , полученных в разных
1 2
условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R
_
Хl
при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3.
Если условие не выполняется, эксперимент
повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины,
приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
10.4. Контроль
точности
Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении
результата контрольной процедуры, равного разности между результатом
контрольного измерения содержания хлорированных соединений (хлороформ,
тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан, хлорбензол) в пробе с известной добавкой
_ _
(Х'), в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С
д
(добавка должна составлять не менее 40% от содержания компонента в рабочей
пробе) с нормативом точности К.
Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется
условие:
_ _
|Х' - Х - С | = К ,
д k
где:
_
Х' - средний результат контрольного измерения содержания определяемого
компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных
измерений, мкг/куб. см;
_
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого
компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;
С - величина добавки к пробе, мкг/куб. см.
д
______________________________
/дельта _ 2 дельта _ 2
К = 0,84 х /(------ х Х) + (------ х Х' ) .
\/ 100 100
Качество контрольной процедуры признают удовлетворительной при
выполнении условия: К <= К.
k
При превышении норматива контроля К эксперимент повторяют. При повторном превышении
указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным
результатам контроля, и устраняют их.
Периодичность контроля исполнения
процедуры ВКК регламентируют согласно руководству по качеству лаборатории.
Литература
1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова
Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные
углеводородов: Справ. изд./Под
ред. В.А.Филова и др. Л.: "Химия", 1990.
Методические указания разработаны
Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии
(Т.С.Уланова, Т.В.Нурисламова, Н.А.Попова).