6. Диагноз на листериоз считается установленным при получении положительного результата РНФ; обнаружении листерий в патматериале иммунофлюоресцентным методом, а также при выделении грамположительной полиморфной подвижной палочки, образующей каталазу и разлагающей с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, трегалозу и салицин; вызывающей (вирулентные штаммы) положительные конъюнктивальную и дермонекротическую пробы у морских свинок и кроликов; дающей положительную РА с листериозной сывороткой; лизирующейся листериозным бактериофагом; обладающей патогенностью для лабораторных животных (вирулентные штаммы).

7. ПАТОЛОГОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

7.1. Для патологогистологического исследования необходимо брать следующие материалы: кусочки головного мозга (все отделы), спинного мозга и паренхиматозных органов.

7.2. Материал фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального формалина, с последующим заключением в парафин и окраской гематоксилинэозином или в жидкости Карнуа с окраской по Браше, или в 96 град. этиловом спирте с окраской по Нисслю.

7.3. Гистологические изменения наиболее сильно проявляются в головном и спинном мозге, где хорошо выражены периваскулиты, состоящие из лимфоцитов и гистиоцитов; отек, дегенерация нейронов, нейронофагия, микроабсцессы и некротические очаги. Наличие микрофокусного энцефалита, проявляющегося очагами, состоящими из скопления моноцитарных и лимфоидных клеток с примесью сегментоядерных лейкоцитов, является отличительным признаком от энцефалита вирусного происхождения.

При септической форме болезни в печени, селезенке, надпочечниках обнаруживают гранулемы, состоящие из клеток лимфоидно-гистиоцитарного типа.

7.4. При гистологическом исследовании органов ягнят часто находят зернистую дистрофию клеток печени и почек; воспалительные изменения в тонком отделе кишечника и сычуге, мелкоочаговую бронхопневмонию.

7.5. Для экспрессной диагностики листериоза используют прямой или непрямой метод флюоресцирующих антител для выявления листерий в гистологических срезах проб органов и тканей животных и человека.

7.5.1. Для исследования необходимо иметь:

- листериозную культуру для контроля активности люминесцирующих сывороток;

- пробы органов и тканей для исследования, которые в случае хранения замораживают при - 8-10 град. C;

- люминесцирующую листериозную сыворотку (для прямого метода) или поливалентную листериозную кроличью сыворотку (если имеются, то и серогрупповые) и флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика;

- микротом с ножом глубокого охлаждения или микрокриостат (криостат);

- люминесцентный микроскоп;

- чистый ацетон;

- 0,15 М раствор хлорида натрия;

- смесь глицерина (1 часть) и 0,15 М NaCl (9 частей);

- нефлюоресцирующее иммерсионное масло или его заменитель - диметилфталат;

- предметные и покровные стекла;

- 10%-ный формалин.

7.5.2. Если невозможно исследовать материал на месте, то кусочки органов и тканей размером 1х1, 5х2 см помещают в плотно закрываемую стеклянную тару и заливают 10%-ным формалином. В таком виде материал пересылают в лабораторию.

7.5.3. Для приготовления рабочих разведений сухую люминесцирующую сыворотку (для прямого метода) или флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика (для непрямого метода) сначала растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. При наличии осадка сыворотку центрифугируют. Перед нанесением на гистологические срезы тканей флюоресцирующую сыворотку разводят раствором 0,15 М хлорида натрия до рабочего титра, который указан на ампуле.

7.5.4. Методика приготовления гистологических срезов: из нефиксированных проб органов и тканей готовят на замораживающем микротоме с ножом глубокого охлаждения или криостате (микрокриостате) срезы толщиной не более 5-8 микрон в количестве 2-3 с каждой пробы; полученные срезы наклеивают на обезжиренные предметные стекла без клеящих растворов, фиксируют чистым ацетоном в течение 15 минут и подсушивают на воздухе; материал, фиксированный в 10%-ном формалине, режут на обычном замораживающем микротоме толщиной не более 5-8 микрон, срезы промывают 30 минут в физиологическом растворе и наносят на чистые обезжиренные предметные стекла с наклеивающей жидкостью (белок). Приготовленные срезы на предметных стеклах подсушивают при комнатной температуре или в термостате до полного высыхания.

7.5.5. Окрашивание срезов прямым методом люминесцирующих антител: на срезы наносят 2 капли флюоресцирующей листериозной сыворотки и препараты выдерживают во влажной камере (в чашках Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) при комнатной температуре в течение 30 минут; препараты промывают 2 раза по 10 минут раствором 0,15 М хлорида натрия и 1 раз 10 минут дистиллированной водой, затем высушивают при температуре 35-40 град. C в течение 15-20 минут.

7.5.6. Окрашивание срезов непрямым методом флюоресцирующих антител: на срезы наносят 1-2 капли поливалентной листериозной агглютинирующей кроличьей сыворотки, выдерживают в течение 60 минут во влажной камере при комнатной температуре; сыворотку смывают в течение одной минуты физиологическим раствором хлорида натрия. Остатки раствора удаляют со стекла фильтровальной бумагой; наносят 1-2 капли флюоресцирующей сыворотки против глобулинов кролика в рабочем разведении и выдерживают 30 минут при комнатной температуре в закрытых чашках Петри; препараты промывают 2 раза по 10 минут физиологическим раствором хлорида натрия и 10 минут дистиллированной водой, а затем высушивают в термостате при 35-40 град. C в течение 15-20 минут.

7.5.7. Для люминесцентной микроскопии окрашенные препараты (как прямым, так и непрямым методами) заключают в буферную смесь из 1 части глицерина и 9 частей 0,15 М NaCl. Гистологические срезы накрывают покровным стеклом, на которое наносят одну каплю нефлюоресцирующего иммерсионного масла (или диметилфталата) и исследуют в люминесцентном микроскопе.

7.5.8. Для контрастирования фона препарата при окрашивании гистологических срезов можно применять совместно с флюоресцирующей сывороткой бычий альбумин, меченный родамином (согласно наставлению по его применению), который окрашивает исследуемую ткань и постороннюю микрофлору в оранжево-красный цвет (различных оттенков). На этом фоне листерии четко выделяются специфическим золотисто-зеленоватым свечением.

7.5.9. В качестве контроля при исследовании проб органов и тканей необходимо ставить контроли с нормальной сывороткой, а также во всех случаях проводить окрашивание культуры листерий люминесцирующей сывороткой.

7.5.10. Оценку интенсивности свечения листерий проводят согласно п. 4.6.2.2.

Положительным результатом обнаружения листерий считается наличие светящихся клеток соответствующей для листерий морфологии, свечение которых оценивается на 4 и 3 креста.

8. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Для серологического исследования берут пробы от животных любого возраста, подозреваемых в заболевании листериозом, а также от животных из поголовья, где заболевание подтверждено.

От каждого животного берут из яремной вены 5-10 куб. см крови в стерильные пробирки или используют кровь, полученную при убое животного.

Из отобранных проб крови получают сыворотку методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин. при температуре 20-30 град. C, а затем при температуре 4-10 град. C. Сыворотка крови должна быть прозрачной, без признаков гемолиза.

Допускается консервировать сыворотку 5%-ным раствором карболовой кислоты (1-2 капли на 1 куб. см сыворотки) или сухой борной кислоты (2% кислоты к объему сыворотки).

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 суток со дня взятия пробы, сыворотки консервированные - в течение 30 суток.

8.1. Реакция агглютинации

8.1.1. Реакцию агглютинации (РА) в диагностике листериоза применяют для исследования сывороток животных с целью обнаружения листериозных агглютинирующих макроглобулиновых (19S) и микроглобулиновых (7S) антител.

8.1.2. Результаты РА используют при постановке диагноза в комплексе с другими данными (бактериологическое исследование, эпизоотическая ситуация, клинические признаки, патологоанатомические изменения), а также для выявления скрыто больных и переболевших животных.

8.1.3. Компоненты реакции и условия их применения

8.1.3.1. Для исследования используют консервированные и неконсервированные сыворотки крови без признаков гнилостного распада гемолиза.

8.1.3.2. В реакции применяют антигены первой и второй серогрупп, представляющие собой взвесь инактивированных листерий, выпускаемые в лиофилизированном виде. Перед применением необходимо добавить к ним физиологический раствор pH 7,2 в количестве, указанном на этикетке. Разведенные антигены можно хранить при 4 град. C  в течение 1,5-2 месяцев. Перед употреблением антигены тщательно встряхивают.

8.1.3.3. Для контроля используют первую и вторую серогрупповые агглютинирующие листериозные сыворотки, содержащие 19S - и 7S - антитела, а также нормальную (отрицательную) сыворотку.

8.1.3.4. Для дифференцирования 19S - и 7S - антител используют 2-меркаптоэтанол (2-МЭ) или солянокислый цистеин, которые избирательно разрушают макроглобулины (19S).

8.1.4. Постановка реакции агглютинации

8.1.4.1. Испытуемые сыворотки исследуют параллельно с двумя антигенами. При исследовании сывороток крупного рогатого скота и лошадей, реакцию ставят в разведениях 1:160 и 1:320, овец, коз и свиней - 1:80 и 1:160, кроликов 1:20 и 1:40. Разведения сывороток делают в физиологическом растворе.

8.1.4.2. Реакцию проводят в объеме 1 мл. При исследовании сывороток кроликов в первую пробирку наливают 0,9 мл физиологического раствора, во вторую - 0,5 мл. Затем в первую пробирку добавляют 0,1 мл сыворотки, перемешивают и переносят 0,5 мл во вторую пробирку. Из второй пробирки 0,5 мл смеси удаляют. Получают разведение сывороток 1:10 и 1:20. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают разведение сывороток 1:20 и 1:40.

8.1.4.3. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей сначала готовят основное разведение сыворотки - 1:40, для чего в пробирки наливают 0,1 мл сыворотки и 3,9 мл физиологического раствора. Затем из полученного разведения готовят рабочие разведения сыворотки: наливают в две пробирки по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку переносят 0,5 мл основного разведения сыворотки, перемешивают и 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем из нее удаляют 0,5 мл смеси, после чего в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают разведение сывороток 1:160 и 1:320.

8.1.4.4. При исследовании сывороток крови овец, коз и свиней готовят основное разведение сыворотки - 1:20 (0,1 мл сыворотки + 1,9 мл физиологического раствора). Для приготовления рабочих разведений наливают в две пробирки по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку переносят 0,5 мл основного разведения сыворотки, перемешивают и 0,5 мл смеси из нее переносят во вторую пробирку. Из второй пробирки удаляют 0,5 мл смеси. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают необходимое разведение сыворотки 1:80 и 1:160.

8.1.4.5. При постановке реакции с испытуемыми сыворотками одновременно ставят следующие контроли:

- с отрицательной сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые;

- с положительной агглютинирующей сывороткой соответствующего серовара, содержащей 7S - антитела, в разведении до ее предельного общего титра;

- 1 мл разведенного антигена первой серогруппы (одну пробирку) и 1 мл разведенного антигена второй серогруппы (одну пробирку) - для контроля антигена.

8.1.4.6. Пробирки с испытуемыми и контрольными сыворотками и антигенами выдерживают в термостате 18-20 часов при 37 град. C, затем при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов, после чего учитывают результаты реакции.

8.1.5. Учет и диагностическая оценка реакции

8.1.5.1. Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ полное просветление жидкости при наличии четко выраженного зонтика, который при встряхивании разбивается на мелкие хлопья, комочки;

+++ те же явления, но надосадочная жидкость слегка опалесцирует;

++ просветление жидкости выражено слабее, имеется недостаточно четко сформированный зонтик, при встряхивании разбивается на мелкие хлопья и крупинки;

+ незначительное просветление при наличии зонтика, при встряхивании - мелкие крупинки и комочки;

- отрицательная, отсутствие просветления и зонтика.

8.1.5.2. Реакция признается положительной при обнаружении агглютинации, с оценкой не менее, чем на два креста в разведениях сыворотки 1:160 для овец, свиней и коз; 1:320 для крупного рогатого скота, лошадей; 1:40 для кроликов. Сыворотки, давшие отрицательную реакцию в указанных разведениях, подлежат дополнительной обработке 2-МЭ или солянокислым цистеином (см. пункты 8.1.6.-8.1.7.).

8.1.6. Обработка сывороток 2-МЭ

8.1.6.1. 2-МЭ - бесцветная жидкость, обладающая запахом, поэтому работу с 2-МЭ проводят в вытяжном шкафу. Рабочий раствор 2-МЭ готовят непосредственно перед применением, разводя исходный препарат дистиллированной водой согласно титру, указанному на этикетке флакона.

8.1.6.2. Сыворотки крови кроликов разводят физиологическим раствором 1:5 (0,2 мл сыворотки + 0,8 мл физиологического раствора), сыворотки овец, коз и свиней - 1:10 (0,1 мл сыворотки ++ 0,9 мл физиологического раствора), сыворотки крови крупного рогатого скота и лошадей - 1:20 (0,05 мл сыворотки + 0,95 мл физиологического раствора).

8.1.6.3. Затем к 1 мл разведенной сыворотки добавляют 1-2 капли рабочего разведения 2-МЭ. Пробирки плотно закрывают резиновыми пробками и помещают в водяную баню (37 град. C) на 1 час. После этого сыворотку, обработанную 2-МЭ, разливают в 2 пробирки по 0,5 мл и в одну из них добавляют 0,5 мл разведенного антигена первой серогруппы, в другую - 0,5 мл разведенного антигена второй серогруппы. Получают разведение 1:10 для сывороток кроликов, 1:20 - овец, коз и свиней, 1:40 - для сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей.

8.1.6.4. При постановке реакции с испытуемыми сыворотками одновременно ставят следующие контроли:

- с отрицательной сывороткой в том же разведении, как и испытуемые;

- с агглютинирующей сывороткой, содержащей 19S - антитела, в том же разведении, что и испытуемые;

- с агглютинирующей сывороткой, содержащей 7S - антитела, в разведении до предельного титра 7S - антител;

- 1 мл разведенного антигена первой серогруппы (одна пробирка) и 1 мл разведенного антигена второй серогруппы (одна пробирка) - для контроля антигена.

8.1.6.5. Агглютинирующие контрольные сыворотки обрабатывают 2-МЭ так же, как и испытуемые. Отрицательная сыворотка обработке 2-МЭ не подлежит.

8.1.6.6. Пробирки с контрольными и испытуемыми сыворотками и антигенами выдерживают в термостате 18-20 часов при 37 град. C, затем при комнатной температуре 1,5-2 часа, после чего учитывают результаты реакции.

8.1.7. Обработка сывороток солянокислым цистеином

Раствор цистеина готовят непосредственно перед применением. Для получения рабочего раствора цистеина 35,1 мг препарата растворяют в 1 мл 0,2 М NaOH. Для приготовления 0,2 М раствора едкого натра растворяют 8 г реактива в 1 л дистиллированной воды.

Сыворотки крови кроликов разводят в 2,5 раза (0,2 мл сыворотки + 0,3 мл физраствора), сыворотки овец, коз и свиней - 1:5 (0,1 мл сыворотки + 0,4 мл физраствора), сыворотки крупного рогатого скота и лошадей - 1:10 (0,05 мл сыворотки + 0,45 мл физраствора). Затем к 0,5 мл разведенной сыворотки добавляют 0,5 мл рабочего раствора цистеина. Пробирки закрывают резиновыми пробками и выдерживают в течение 18-20 часов в термостате при 37 град. C. После этого сыворотку, обработанную цистеином, разливают в 2 пробирки по 0,5 мл, в одну из них добавляют 0,5 мл разведенного антигена первой серогруппы, в другую - 0,5 мл разведенного антигена второй серогруппы. Получают разведение сыворотки 1:10 для кроликов, 1:20 - для овец, коз и свиней и 1:40 для крупного рогатого скота и лошадей.

Контроли реакции ставят как при обработке сывороток 2-МЭ с последующим выдерживанием испытуемых и контрольных проб при 37 град. C (18-20 часов) и при комнатной температуре (1,5-2 часа).

8.1.8. Учет и оценка реакции после обработки сывороток 2-МЭ или солянокислым цистеином

8.1.8.1. Реакция признается положительной при обнаружении агглютинации с оценкой не менее, чем на два креста в сыворотках, обработанных 2-МЭ или цистеином, в разведении 1:10 для кроликов, 1:20 - для овец, коз и свиней, 1:40 - для крупного рогатого скота и лошадей. При этом контрольная агглютинирующая сыворотка, содержащая 19S - антитела, должна дать отрицательную реакцию в том же разведении, а контрольная сыворотка, содержащая 7S - антитела, - положительную реакцию в разведении до предельного титра 7S - антител.

8.1.8.2. При оценке реакции необходимо учитывать, что цистеин легко окисляется на воздухе, образуя мелкие крупинки, которые можно легко отличить от специфической агглютинации.

8.1.8.3. В заключении лаборатории о результатах исследования проб сывороток крови должна быть сообщена диагностическая оценка результатов исследования (положительная или отрицательная).

8.2. Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) с листериозным антигеном применяется для исследования на листериоз сывороток крови всех видов животных и человека.

Применение РСК не исключает применения других методов диагностики листериоза, однако ценность этой реакции состоит в том, что она ускоряет постановку диагноза и позволяет выявлять больных животных, не имеющих выраженных клинических признаков болезни (листерионосителей).

Реакцию ставят в водяной бане в общем объеме 1,0 мл всех компонентов при температуре 37-38 град. C.

8.2.1. Компоненты реакции и условия их применения:

- гемолизин с рабочим титром не ниже 1:500; титрование гемолизина по общепринятой схеме проводят периодически 1 раз в 3 месяца, а также при получении каждой новой серии;

- листериозный антиген для РСК; применяют в рабочем титре, указанном на этикетке флакона; срок годности антигена 2 года при условии хранения его в темном прохладном месте (5-10 град. C);

- позитивные листериозные сыворотки (ТУ 46-21-182-75); используют при титровании комплемента в бактериолитической системе и для контроля реакции в главном опыте после предварительной инактивации в день постановки реакции в разведении 1:10 в течение 30 минут при 56-60 град. C (сыворотки крупного рогатого скота и свиней при 56-57 град. C, лошадей и овец при 58-59 град. C, кроликов - 60 град. C).

Примечание: Обработка сывороток морских млекопитающих (ластоногих и китообразных) CO2, для снятия антикомплементарности с последующим традиционным прогреванием для инактивации комплемента изложена в приложении 10.3.

- нормальные сыворотки заведомо здоровых животных тех же видов, как и испытуемые; применяют при титровании комплемента в бактериолитической системе и для контроля реакции в главном опыте так же, как и позитивные сыворотки после предварительной инактивации при указанном режиме и в таких же дозах;

- комплемент сухой для РСК (ГОСТ 16446-78); применяется в титре, установленном в день постановки реакции путем титрования в бактериолитической системе;

- 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе; лучше применять сенсибилизированные эритроциты (гемолитическую систему). Для сенсибилизации эритроцитов гемолитическую систему (смесь равных объемов 2,5%-ной взвеси эритроцитов и рабочего разведения гемолизина) выдерживают в водяной бане при 37-38 град. C в течение 20 минут; гемолитическую систему применяют в реакции в дозе 0,4 мл;

- физиологический раствор (0,85%-ный) химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде pH 7,0-7,2.

8.2.2. Титрование компонентов

Перед постановкой главного опыта проводят титрование компонентов реакции: гемолизина и комплемента в гемолитической и бактериолитической системах.

Титрование гемолизина.

Гемолизин титруют в разведениях: 1:1000, 1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500, 1:3000 и т.д., которые готовят из основного его разведения 1:100.

Комплемент используют в реакции в разведении 1:10 или 1:20 по 0,2 мл. Взвесь эритроцитов барана по 0,2 мл. Взамен антигена и сыворотки в пробирки прибавляют по 0,4 мл физиологического раствора. Время течения реакции - 10 минут в водяной бане при температуре 37-38 град. C.

При титровании гемолизина ставят следующие контроли:

- гемолизин 1:100 с эритроцитами и физраствором в отсутствии комплемента;

- комплемент с эритроцитами и физраствором в отсутствии гемолизина;

- эритроциты с физраствором в отсутствии гемолизина и комплемента.

Во всех контролях гемолиз эритроцитов должен отсутствовать.

Титром гемолизина считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,2 мл взвеси эритроцитов при комплементе 0,2 мл в разведении 1:10 или 1:20.

Для титрования комплемента и постановки главного опыта гемолизин применяют в рабочем титре, который является четырехкратной дозой по сравнению с предельным титром. Например, если предельный титр равен 1:2000, то в реакции следует применять разведение 1:500, для чего к 1 мл гемолизина приливают 499 мл физиологического раствора (таблица 2).

Таблица 2

Титрование гемолитической сыворотки

Примечание: В данном примере предельный титр гемолитической сыворотки равен 1:2000, а для реакции следует применять ее в титре 1:500.

Титрование комплемента в гемолитической системе.

Комплемент титруют в дозах 0,02, 0,04, 0,06 и т.д. (с интервалом по 0,02 мл) до 0,20 мл основного его разведения. В каждую пробирку к недостающему до 0,2 мл количеству основного разведения комплемента добавляют физиологический раствор: в первую пробирку 0,18 мл, во вторую 0,16 мл и т.д. После этого во все пробирки наливают по 0,4 мл физиологического раствора и по 0,4 мл гемолитической системы. Реакция должна сопровождаться контролями компонентов в смеси с эритроцитами (контроль гемолизина, контроль комплемента, контроль физраствора), а также контролем гемолитической системы при максимальной дозе комплемента (0,2 мл основного разведения). После тщательного смешивания компонентов путем встряхивания, штативы с пробирками помещают на 10 минут в водяную баню при 37-38 град. C.

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в указанных условиях 0,2 мл взвеси эритроцитов при рабочей дозе гемолизина (таблица 3).

Если титр комплемента в гемолитической системе определяется дозой 0,18 мл и выше (основное разведение 1:20), то титрование в гемолитической системе повторяют, пользуясь основным разведением комплемента 1:10.

Таблица 3

Титрование комплемента в гемолитической системе

Примечание:

ЗГ - задержка гемолиза

ЧГ - частичная задержка гемолиза

ПГ - полный гемолиз

Титрование комплемента в бактериолитической системе.

В бактериолитической системе комплемент титруют, начиная с дозы на один - два интервала ниже против его титра в гемолитической системе. Если титр комплемента в гемолитической системе определяется дозой 0,08 мл основного разведения, то в бактериолитической системе его титруют в дозах: 0,04; 0,06; 0,08; 0,10 и т.д. до 0,20 мл того же основного разведения.

Каждую дозу комплемента исследуют с двумя листериозными и с двумя нормальными сыворотками в присутствии антигена (в рабочем титре) и с контролем сывороток без антигена.

Инактивированные в разведении 1:10 листериозные и нормальные сыворотки разливают по 0,2 мл в пробирки соответствующих рядов.

Таким образом, в бактериолитической системе комплемент титруют в 8-ми рядах пробирок (по 9 пробирок в каждом ряду).

Требуемые разведения комплемента целесообразно готовить сразу для всего опыта титрования; с этой целью берут дополнительный ряд пробирок, в который разливают применяемые при титровании дозы комплемента в десятикратном объеме, т.е. - 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 и т.д. до 2,0 мл. Недостающий до 2 мл объем жидкости в пробирках доливают соответствующим количеством физиологического раствора: 1,6; 1,4; 1,2; 1,0 и т.д. Приготовленные таким способом разведения комплемента разливают пипеткой или аппаратом Флоринского в соответствующие опытные пробирки по 0,2 мл: в первые пробирки всех 8-ми рядов из первого разведения (доза основного разведения 0,04 мл), во вторые пробирки всех 8-ми рядов из второго разведения (доза основного разведения 0,06 мл) и т.д. После разлива комплемента, в первые ряды пробирок с листериозными и нормальными сыворотками наливают по 0,2 мл антигена в рабочем титре, во вторые по 0,2 мл физиологического раствора. Компоненты смешивают энергичным встряхиванием штативов и помещают в водяную баню при 37-38 град. C на 20 минут (связывание комплемента). Затем во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы, компоненты смешивают и штативы снова помещают в водяную баню при 37-38 град. на 20 минут (фаза гемолиза).

Титром комплемента в бактериолитической системе является минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз в пробирках с нормальными сыворотками с антигеном и без антигена, с листериозными сыворотками без антигена, при задержке гемолиза в пробирках с листериозной сывороткой и антигеном в течение 20 минут при 37-38 град. C (таблица 4), что принимается за рабочий титр комплемента для главного опыта.

8.2.3. Главный опыт

Разведение комплемента для главного опыта.

Количество чистого комплемента, необходимого для всего опыта, определяется по формуле:

                            A x B

                            ----- x 2,

                              C

Где: A - титр комплемента, установленный в баксистеме;

B - количество проб, подлежащих исследованию;

C - разведение комплемента.

Например, требуется произвести исследование 100 проб сывороток (с антигеном и без, т.е. 200 пробирок). Титр комплемента в бактериолитической системе 0,10 мл основного разведения 1:10.

                                            0,10 x 100 x 2

     Доза чистого комплемента равна 2,0 мл (--------------).

                                                  10

Количество разведенного комплемента для исследования 100 проб равно 40 мл (0,2 x 200), поэтому к 2,0 мл чистого комплемента следует добавить 38,0 мл физраствора.

Основные условия постановки главного опыта.

Реакцию ставят в общем объеме 1,0 мл всех компонентов, т.е. каждый компонент применяют в объеме 0,2 мл. Испытуемые сыворотки исследуют с антигеном и без антигена в разведении 1:10 после предварительной инактивации в водяной бане при температуре 56-60 град. C и выше, в зависимости от вида животных, в течение 30 минут. Комплемент применяют в установленном титре. Время связывания комплемента в бактериолитической системе 20 минут, реакция гемолиза - 20 минут (в водяной бане при 37-38 град. C).

Таблица 4

Титрование комплемента в бактериолитической системе

Примечание: ЧГ - частичный гемолиз; ПГ - полный гемолиз.

Основные контроли главного опыта:

- отрицательная и положительная (листериозная) сыворотки в разведении 1:10 с антигеном и без антигена;

- антиген на антикомплементарность и гемотоксичность (двойная доза антигена с комплементом в рабочем титре и без комплемента), компоненты смешивают и ставят в водяную баню на 20 минут; после чего добавляют гемолитическую систему по 0,4 мл и снова выдерживают в водяной бане в течение 20 минут;

- гемолитическая система с комплементом и без комплемента;

- комплемент в двойной дозе с эритроцитами без гемолизина.

8.2.4. Учет и оценка результатов реакции.

Результаты реакции оценивают по степени задержки гемолиза эритроцитов в крестах 2 раза: первый раз - тотчас после водяной бани, второй раз - через 14-18 часов выдерживания проб при комнатной температуре по следующей схеме:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза эритроцитов, надосадочная жидкость прозрачная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

- (минус) - полный гемолиз, осадок отсутствует.

Реакцию считают: положительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста; сомнительной - при задержке гемолиза на 2 креста; отрицательной - при задержке гемолиза на 1 крест или полном гемолизе эритроцитов.

Животные, с сыворотками крови которых получены сомнительные реакции, подлежат повторному исследованию через 2-3 недели. При повторном получении сомнительной реакции результат исследования считают отрицательным.

8.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) при листериозе людей и животных

8.3.1. Общие положения.

8.3.1.1. РНГА с листериозным антигенным инактивированным эритроцитарным диагностикумом (ЭД) применяют при исследовании сывороток крови людей и животных для обнаружения листериозных антител с целью диагностики болезни.

8.3.1.2. РНГА рекомендуется для оперативных и диагностических серологических обследований с целью выявления закономерностей формирования противолистериозного иммунитета у различных групп людей и животных.

8.3.1.3. Определение возрастных, сезонных, профессиональных среднемноголетних колебаний уровня иммунитета является необходимым для всестороннего анализа напряженности эпизоотического и эпидемического процесса на конкретной географической территории.

8.3.1.4. РНГА используют для дифференциации противолистериозных 19S- и 7S - антител, что дает возможность отличить свежий инфекционный процесс от скрытого бактерионосительства и хронических малосимптомных форм заболевания.

8.3.1.5. РНГА также применяют для дифференциации поствакцинальных антител от постинфекционных.

8.3.1.6. РНГА - доступный, экономичный, легко воспроизводимый метод, позволяющий получать стандартные результаты и исследовать большое количество проб сывороток крови в весьма короткие сроки.

8.3.2. Компоненты реакции и условия их применения.

8.3.2.1. Солевые растворы и их приготовление:

- физиологический раствор (pH 7,0-7,2) для растворения сухой гипериммунной листериозной кроличьей сыворотки: 8,5 г хлорида натрия на 1 л дистиллированной воды;

- 0,15 М фосфатный буферный раствор (pH 7,2) для приготовления исходных разведений исследуемых сывороток, 0,2 М раствора солянокислого цистеина и постановки РНГА: раствор 1-21,19 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4x2H2O), предварительно высушенного в течение 3 суток при 37 град. C, растворяют в 1 л дистиллированной воды; раствор 2-20,41 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для получения 100 мл фосфатного буферного раствора (pH 7,2) 76,1 мл раствора 1 смешивают с 23,9 мл раствора 2;

- раствор мертиолата для консервирования исследуемых сывороток: препарат растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1:1000. Для консервирования сывороток используют приготовленный раствор мертиолата из расчета 1:10, т.е. конечная концентрация реактива должна составлять 1:10000.

8.3.2.2. Сухая гипериммунная листериозная кроличья сыворотка, используемая как положительный контроль, характеризующий чувствительность эритроцитарного диагностикума. Сыворотку раcтворяют физиологическим раствором до ее первоначального объема, указанного на этикетке ампулы.

8.3.2.3. 50%-ная взвесь формалинизированных бараньих эритроцитов для адсорбции исследуемых сывороток, содержащих антитела к эритроцитам барана.

8.3.2.4. Сухие контрольные формалинизированные эритроциты барана, представляющие 0,33%-ную взвесь после растворения в фосфатном буферном растворе (pH 7,2) в объеме, указанном на этикетке ампулы.

8.3.2.5. Сухой ЭД, представляющий формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные инактивированным антигеном возбудителя листериоза. Антиген приготовлен из штамма листерий 9-127 первого серовара методом гидролиза предварительно высушенной в ацетоне бактериальной массы в фосфатном буферном растворе (pH 6,4).

Сухой ЭД и контрольные к нему эритроциты имеют вид пористой коричневой таблетки, которая при добавлении дистиллированной воды в течение 2 минут образует однородную взвесь коричневого цвета.

8.3.2.6. Для исследования используют свежие и консервированные сыворотки крови без признаков гнилостного распада и гемолиза.

8.3.2.7. Для дифференциации 19S - и 7S - антител, позволяющей отличить свежий инфекционный процесс от скрытого бактерионосительства и хронических малосимптомных форм заболевания, а также постинфекционное иммунное состояние от поствакцинального, используют 0,2 М раствор солянокислого цистеина. Его готовят перед использованием: 35,1 мг препарата растворяют в 1 мл 0,2 М раствора едкого натра.

8.3.2.8. Приготовление 0,2 М раствора едкого натра: 8 г реактива растворяют в 1 л фосфатного буферного раствора (pH 7,2).

8.3.3. Исследование сывороток крови людей и животных в РНГА.

8.3.3.1. Подготовка сывороток к исследованию.

Испытуемые сыворотки крови людей и животных разводят 1:5 в пробирках 0,15 М фосфатным буферным раствором (pH 7,2) для выявления наиболее специфичных 7S - антител, а для выявления антител суммарной активности (19S - + 7S - антитела) сыворотки крови кроликов разводят 1:10, сыворотки крови людей - 1:40, мелкого рогатого скота и свиней - 1:80, а крупного рогатого скота - 1:160. До постановки РНГА разведенные сыворотки, предназначенные для обнаружения антител суммарной активности, сохраняют при 4 град. C.

В пробирки с сыворотками, разведенными 1:5, вносят равный объем 0,2 М раствора солянокислого цистеина, получая исходное разведение 1:10. Эти пробирки закрывают резиновыми пробками и выдерживают при 37 град. C 2 часа. После этого, обработанные и необработанные раствором солянокислого цистеина, сыворотки исследуют в РНГА.

8.3.3.2. Подготовка к работе эритроцитарного диагностикума.

Для получения 0,33%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов сухой препарат растворяют 0,5 мл дистиллированной воды и к полученному объему добавляют 5,5 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2). Эритроцитарный диагностикум выдерживают 20 минут, хорошо перемешивая, при комнатной температуре.

8.3.3.3. Постановка РНГА микрометодом.

Реакцию ставят в объеме 0,1 мл. В каждую лунку капельницей вносят по 0,05 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2). В первую лунку ряда прибавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки в соответствующем разведении. С помощью микродилюторов по 0,05 мл сыворотки переносят из первой лунки во вторую, из второй в третью и т.д., т.е. готовят последовательные двукратные разведения. С целью выявления 7S - антител у людей и всех видов животных разведения в лунках должны соответствовать значениям 1:20 и 1:40. Для выявления антител суммарной активности пробы сывороток крови кроликов должны быть разведены в лунках с 1:20 до 1:80, людей - с 1:80 до 1:640, мелкого рогатого скота и свиней - с 1:160 до 1:640, а крупного рогатого скота - с 1:320 до 1:640. При получении положительных результатов определяется максимальный титр сывороток. После титрования и каждую лунку вносят по 0,05 мл 0,33%-ной взвеси ЭД. Панели оставляют при комнатной температуре и через 3-4 часа проводят предварительный учет результатов, а окончательный учет осуществляют на следующий день. Можно учитывать результат однократно после выдерживания панелей при 4 град. C в течение 16-18 часов.

8.3.3.4. Контроли, используемые в реакции:

- контроль ЭД и несенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.

Для этого в одну лунку к 0,05 мл фосфатного буферного раствора (pH 7,2) добавляют 0,05 мл 0,33%-ной взвеси ЭД, а в другую лунку к тому же количеству буферного раствора - 0,05 мл контрольных 0,33%-ных несенсибилизированных эритроцитов;

- контроль специфичности РнГА для каждой исследуемой сыворотки.

Для этого к 0,05 мл исследуемой сыворотки в наибольшей для данного опыта концентрации добавляют 0,05 мл 0,33%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов.

Во всех указанных случаях контроли должны быть отрицательными, т.е. агглютинации не должно быть. В случае положительного контроля исследуемой сыворотки, ее адсорбируют 50%-ной взвесью формалинизированных эритроцитов барана согласно п. 8.3.3.5.;

- контроль чувствительности эритроцитарного диагностикума: титруют в объеме 0,05 мл гипериммунную листериозную кроличью сыворотку до титра, указанного на этикетке ампулы; в каждую лунку добавляют 0,05 мл 0,33%-ной взвеси ЭД. С учетом результатов серологических реакций в дальнейшем может быть использован ЭД, дающий реакцию с листериозной сывороткой не менее 1/3 ее предельного титра (положительный контроль).

8.3.3.5. В случае необходимости адсорбции исследуемых сывороток бараньими эритроцитами к 1 мл сыворотки добавляют 2 капли (0,1 мл) 50%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов. Смесь встряхивают и выдерживают 30 минут при 37 град. C или 60 минут при 20-22 град. C, либо 18 часов при 4 град. C. Сыворотку центрифугируют при 1,5 тыс. оборотов в мин. в течение 10 минут или отстаивают, после чего проводят ее повторное исследование в РНГА.

8.3.3.6. При использовании макрометода РНГА ставят в объеме 0,4 мл. В каждую лунку пипеткой вносят по 0,2 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2). В первую лунку ряда прибавляют 0,2 мл исследуемой сыворотки в соответствующем разведении. С помощью пипеток переносят по 0,2 мл сыворотки из первой лунки во вторую, из второй в третью и т.д., т.е. готовят последовательные двукратные разведения (п. 8.3.3.3.). После титрования в каждую лунку вносят по 0,2 мл 0,33%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума. Учет результатов проводят также как и при микрометоде (п. 8.3.4.).

8.3.4. Учет и оценка РНГА.

8.3.4.1. Учет результатов реакции проводят по четырехплюсовой системе:

++++ эритроциты покрывают все дно лунки ровным слоем, наблюдается картина "зонтика" с ровными краями;

+++ эритроциты покрывают дно лунки "зонтиком" несколько меньшего размера;

++ маленький "зонтик" с неровными краями и "пуговкой" в центре;

+ "пуговка" в центре лунки, имеются отдельные зерна агглютината; "пуговка" с ровными четко очерченными краями.

8.3.4.2. Реакция считается положительной, если наблюдается агглютинация на три и четыре плюса.

8.3.4.3. Оценку результатов РНГА проводят согласно титрам, указанным в таблице 5, с учетом антител суммарной активности и 7S - антител:

Таблица 5

8.3.4.4. Во всех случаях более достоверные результаты могут быть получены при исследовании парных сывороток.

Для определения динамики нарастания антител суммарной активности первое исследование проводят на 8-9 день от начала болезни, а второе - на 16-18 день.

Для определения динамики нарастания 7S - антител первое исследование проводят также на 8-9 день от начала болезни, а второе - через 21-30 дней.

Нарастание титра антител суммарной активности в 4 и более раза, a 7S - антител - в 2 и более раза подтверждает диагноз листериоза.

8.3.4.5. Примерные значения титров антител суммарной активности и 7S - антител по срокам болезни указаны в таблице 6:

Таблица 6

8.3.4.6. Наиболее специфичные 7S - антитела сохраняются в сыворотке крови людей и животных более трех месяцев, что дает возможность проводить ретроспективный анализ исследуемого материала.

9. Л-ФОРМЫ ЛИСТЕРИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ

Листерии существуют как в классической бактериальной форме, так и в виде Л-форм.

Процесс Л-трансформации бактерий представляет собой широко распространенную биологическую закономерность. Возникают Л-формы под влиянием различных неблагоприятных воздействий и в дальнейшем проявляют высокую устойчивость к факторам, вызвавшим их появление. Частично или полностью утрачивая фрагменты клеточной стенки, Л-формы могут сохранять свою жизнеспособность в условиях, при которых невозможно существование классических бактериальных форм. В результате Л-трансформации в значительной степени изменяются биологические свойства микроорганизмов, что в свою очередь отражается на клиническом течении болезней, затрудняет их диагностику, а в ряде случаев может изменить характер эпидемического и эпизоотического процессов.

Листерии трансформируются в Л-форму под влиянием антибиотиков пенициллинового ряда, тетрациклина, факторов специфической и неспецифической резистентности организма (иммунной сыворотки, комплемента, глицина, лизоцима) и т.д. Трансформация происходит, когда перечисленные агенты не оказывают достаточного бактериостатического или бактерицидного эффекта. Л-формы, сохранившие фрагменты клеточной стенки, относятся к сферопластному типу. Л-формы, лишенные полностью клеточной стенки, принадлежат к протопластному типу.

При исключении фактора, вызывающего Л-трансформацию, Л-формы могут реверсировать в бактериальную культуру. Реверсирующие Л-формы называются нестабильными, а нереверсирующие - стабильными. Чаще реверсируют Л-формы листерий сферопластного типа.

9.1. Биологические свойства Л-форм листерий

9.1.1. Морфология.

Л-формы листерий имеют существенные морфологические различия с бактериальной формой возбудителя. Они состоят из разнообразных морфологических структур: шаровидных тел и тел неправильной конфигурации, вакуолизированных, гранулярных, зернистых форм и субмикроскопических (фильтрующихся) элементов. Все структуры связаны между собой цепью определенных взаимопревращений и способны к репродукции, размеры их варьируют от 5-8 до 0,15-0,2 мкм, что обуславливает возможность прохождения Л-форм через бактериальные фильтры. Л-формы листерий не отличаются по морфологии от Л-форм других бактерий, что исключает возможность использования этого теста в качестве дифференциального.

9.1.2. Культуральные свойства.

Л-формы листерий растут на полутвердых (1,3%), полужидких (0,3%) и жидких питательных средах. Для поддержания их жизнедеятельности и активной репродукции в среды добавляют 2-2,5% хлорида натрия и 2-5% нормальной лошадиной сыворотки без консерванта. При культивировании нестабильных Л-форм (в отличие от стабильных) в среды дополнительно вносят антибиотики или другие Л-трансформирующие агенты, дозы которых избирательно подбираются в каждом конкретном случае. Оптимальная температура выращивания Л-форм листерий 30 град. C, но они также хорошо растут при 20-37 град. C. На 1,3%-ном агаре Л-формы формируют типичные Л-колонии с оптически плотным гомогенным центром и ажурной периферией. В бульоне они растут в виде изолированных колоний или вызывают равномерное помутнение среды.

9.1.3. Биохимическая активность.

Несмотря на то, что морфология (данные светооптического исследования) и питательные потребности нестабильных и стабильных Л-форм листерий одинаковы, их биохимическая активность различна. Нестабильные Л-формы обычно ферментируют те же дифференциально-диагностические среды, что и бактериальные формы, но кислотообразование у них замедленное. Ферментативная активность стабильных Л-культур может в значительной степени снижаться, вплоть до полной ее утраты в отношении некоторых сахаров и спиртов. Сахаролитическая активность Л-форм листерий, подверженная значительным вариациям, не имеет решающего значения при их идентификации. Однако другие биохимические тесты, такие как каталазная активность и использование глюкозы по гексозомонофосфатному пути, постоянно присущи Л-формам листерий, независимо от степени их стабилизации, и могут быть использованы при идентификации любых форм возбудителя листериоза.

9.1.4. Антигенность и иммуногенность.

Антигенность и иммуногенность Л-форм листерий обусловлены наличием или отсутствием у них фрагментов клеточной стенки.

В антигенном отношении Л-формы сферопластного типа более близки бактериальным формам, чем Л-формы протопластного типа. Чем выше степень сохранности фрагментов клеточной стенки у Л-форм сферопластного типа, тем больше выражено их антигенное родство с бактериальными формами. В этих случаях они могут взаимодействовать с антибактериальной сывороткой в непрямом методе флюоресцирующих антител (НМФА) и в непрямом методе пероксидазных антител (НМПА), окрашиваясь на 3 и 4 креста.

Если степень сохранности фрагментов клеточной стенки у Л-форм сферопластного типа незначительна, то результаты НМФА и НМПА с антибактериальной сывороткой будут отрицательными или сомнительными.

Л-формы листерий протопластного типа не выявляются антибактериальной сывороткой в НМФА и НМПА. Несмотря на значительные изменения антигенных свойств листерий в процессе Л-трансформации, между бактериальными формами и их Л-формами сохраняется определенная общность антигенного строения (таблица 7), которая выявляется в реакциях агглютинации (РА), связывания комплемента (РСК) и диффузионной преципитации в геле (РДП).

Таблица 7

Антигенные связи клеточных компонентов бактериальной

формы листерий и их Л-форм сферопластного и

протопластного типов

Обозначения:

+ результат положительный;

- результат отрицательный;

+/- результат сомнительный;

0 - реакцию не ставили, так как антиген Л-форм антикомплементарен.

Степень сохранности фрагментов клеточной стенки определяет иммуногенность Л-форм листерий. Л-формы протопластного типа обладают наименьшей иммуногенной активностью.

Гипериммунные сыворотки против Л-форм протопластного типа обычно взаимодействуют с гомологичными Л-антигенами в РА 1:80-1:160 и РДП 1:8-1:16, а с антигеном исходной бактериальной формы взаимодействуют в РА 1:10-1:40, РДП 1:2-1:8 и РСК 1:10.

9.1.5. Патогенность.

9.1.5.1. Вирулентные свойства

Нереверсирующие Л-формы сферопластного типа в условиях эксперимента вызывают в организме чувствительных животных изменения, характерные для инфицирования бактериальными культурами листерий. При гистологическом исследовании патологического материала при спонтанном листериозе от погибших людей (детей) и от животных, в органах которых бактериологическими методами были выявлены Л-формы листерий (НМФА они определены как Л-формы сферопластного типа), также обнаруживают изменения, типичные для листериозной инфекции. При нервной форме болезни они характеризуются развитием энцефалита с хорошо выраженным пролиферативным компонентом, наличием отека, дегенерации нейронов и нейронофагии. При септической форме болезни в печени, селезенке, надпочечниках, кишечнике образуются гранулемы, состоящие из клеток лимфоидного и гистиоцитарного типа.

Иным патогенетическим действием обладают Л-формы листерий протопластного типа, не дающие реверсии в условиях организма. Они не вызывают гибели куриных эмбрионов и конъюнктивальной реакции у морских свинок, однако при внутрикожном введении развивается некроз на месте инъекции. Мыши не являются чувствительной моделью для выявления вирулентных свойств стабильных Л-форм листерий протопластного типа. Они не проявляют клинически выраженных признаков заболевания при внутривенном, внутрибрюшинном, внутримозговом и подкожном методах заражения. Кортикостероиды не повышают чувствительность мышей к Л-формам листерий.

К экспериментальному инфицированию стабильными Л-формами листерий протопластного типа чувствительны ягнята. Продолжительность инкубационного периода может исчисляться от нескольких суток до 2-х месяцев. Картина болезни, время ее проявления, а также сроки гибели животных значительно варьируют в зависимости от индивидуальных особенностей организма. В одних случаях Л-формы листерий вызывают нервную форму листериоза, как правило, заканчивающуюся летальным исходом, в других случаях те же дозы возбудителя обуславливают развитие незначительных патологических изменений обратимого характера.

При нервной форме экспериментального листериоза, вызванной стабильными Л-формами листерий, у ягнят нарушается координация движений, появляется "вертячка", перед гибелью развиваются клонические и тонические судороги мышц шеи, туловища, конечностей. Температура тела, как правило, остается в пределах нормы.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что при экспериментальном инфицировании стабильными Л-формами листерий протопластного типа у ягнят в ряде случаев развивается классическая нейросимптоматика, характерная для спонтанного течения инфекции, которую обычно не удается моделировать при инфицировании овец бактериальными культурами.

9.1.5.2. Некоторые особенности патологических изменений, развивающихся в организме при инфицировании стабильными Л-формами протопластного типа.

Клиническая картина нервной формы листериоза является однотипной как для спонтанного листериоза, так и для экспериментального, воспроизводимого Л-формами листерий протопластного типа. Однако, в последнем случае патоморфологическая картина имеет свои особенности. При инфицировании Л-формами протопластного типа в головном и спинном мозге отсутствует пролиферативный компонент воспалительной реакции и на первый план выступают дистрофические и некротические поражения. Наиболее интенсивные изменения локализуются в коре больших полушарий, мозжечке, продолговатом мозге и хвостатом теле. Для поражений мозга характерны гиперемия сосудов и явления стаза, мелкие диапедезные кровоизлияния. Многие нервные клетки находятся в состоянии сильного отека, набухания, цитолиза и кариолизиса. В спинном мозге, кроме аналогичных дистрофических изменений со стороны нервных клеток, выявляют также изменения глиальных клеток. В сером веществе мозга обнаруживают кровоизлияния.

Таким образом, у ягнят развиваются изменения, которые можно отнести к энцефалопатии с распространенными дистрофическими поражениями центральной нервной системы, резким расстройством гемодинамики и почти полным отсутствием воспалительной клеточной реакции.

При летальном исходе дистрофические изменения обнаруживают также в печени, почках, надпочечниках, лимфоидной ткани. В селезенке и лимфатических узлах исчезают реактивые центры, происходит редукция фолликулов и вторичных узелков. У ягнят выявляют полную атрофию костного мозга. В синтиции ретикулярной стромы костного мозга остаются единичные клетки на фоне расширенных капилляров и мелких кровеносных сосудов.

При энцефалопатической форме листериоза, особенно если клиническая картина болезни возникла в отдаленные сроки после заражения, специфические антитела (агглютинины, комплементсвязывающие антитела, преципитины), как правило, отсутствуют. Они не выявляются ни антигеном Л-форм, ни бактериальным антигеном. Показатели лейкоформулы в это время резко изменены. Базофилы, эозинофилы и моноциты исчезают. Число лимфоцитов резко снижено, они дегенеративны. Элементы белой крови представлены, в основном, нейтрофилами, которые также претерпевают дегенеративные изменения. На рис. 1 изображен лейкоцитарный профиль, типичный для овец, больных нервной формой листериоза, в результате экспериментального инфицирования Л-формами листерий протопластного типа.

Рис. 1 Лейкоцитарный профиль овцы

Рисунок не приводится.

Таким образом, в процессе Л-трансформации изменяются морфологические, культуральные, биохимические, иммуногенные и вирулентные свойства листерий. Чем больше степень утраты возбудителем клеточной стенки, тем значительнее эти изменения. Трансформация листерий в Л-форму при спонтанном листериозе объясняет трудность обнаружения возбудителя обычными бактериологическими методами. При естественной листериозной инфекции Л-формы сферопластного типа вызывают в органах хозяина патологические изменения с хорошо выраженным пролиферативным компонентом, которые характерны для листериоза, обусловленного бактериальными формами. В тех случаях, когда возбудитель трансформируется в Л-формы протопластного типа, в организме имеют место дистрофические и некробиотические изменения при почти полном отсутствии пролиферативных явлений. Л-формы листерий протопластного типа являются индукторами энцефалопатической формы листериоза. В настоящее время энцефалопатии листериозной этиологии у людей и животных еще мало известны и почти не изучены.

Пониженная иммуногенная активность Л-форм листерий (особенно протопластного типа) и их способность вызывать атрофию лимфоидной ткани хозяина могут явиться причиной наличия низких титров специфических антител (или отсутствия их) при нервной форме листериоза человека и животных. В подобных случаях исследование сывороток крови в РА, РСК, РДП могут быть не эффективными, необходима бактериологическая диагностика.

9.2. Методы обнаружения Л-форм листерий

Методы обнаружения Л-форм листерий включают посевы патологического материала на питательные среды и идентификацию выделенных культур иммунофлюоресцентным или иммунопероксидазным методами.

9.2.1. Микробиологическое исследование

Из органов и тканей делают посевы на среды, обычно используемые для выделения бактериальных форм листерий [мясопептонный или мясопептонный печеночный агар (МПА, МППА) или бульон (МПБ, МППБ) с добавлением 1% глюкозы и 2-3% глицерина, pH 7,2-7,4] и на полутвердые и жидкие Л-среды для культивирования Л-форм листерий в условиях лаборатории - 1,3%-ный МПА (МППА) и бульон, содержащие 2% хлорида натрия и 2% нормальной лошадиной сыворотки без консерванта.

При отрицательном результате первичного посева рекомендуется сохранять патологический материал в холодильнике при 4 град. C в течение 30 дней и проводить повторные исследования через каждые 10 дней.

Посевы инкубируют в течение 3-4 суток при 30 град. или 37 град. C. При отсутствии роста срок наблюдения увеличивают до 1-1,5 месяцев, но посевы при этом выдерживают при комнатной температуре (20-22 град. C).

Л-формы листерий при первичном посеве из организма могут вырастать не только на Л-среде, но и на обычных бактериальных средах, однако дальнейшие пересевы их, как правило, не удаются.

Выросшие на агаре Л-колонии листерий при визуальном просмотре похожи на бактериальные колонии этого возбудителя и в проходящем свете также имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком. Однако при просмотре в микроскопе (объектив X10) колонии Л-форм имеют не мелкозернистую, характерную для бактериальных колоний, а кружевную структуру. Нередко Л-формы листерий формируют классические Л-колонии, для которых типичен уплотненный, врастающий в агар центр и более светлая ажурная периферия. Величина колоний варьирует от 0,1 до 1-2 мм в диаметре. В жидкой среде Л-формы также могут расти в виде изолированных колоний.

Л-формы листерий обладают каталазной активностью. Выделенные культуры изучают в фазово-контрастном микроскопе, окрашивают по Граму и исследуют иммунофлюоресцентным или иммунопероксидазным методами.

Для окраски по Граму культуру Л-форм наносят на хорошо обезжиренные предметные стекла, подсушивают на воздухе и фиксируют на пламени. Окрашивать по Граму можно изолированные колонии агаровой культуры Л-форм, либо бульонную культуру, если в жидкую среду пересевали колонии с агара. Нельзя окрашивать по Граму бульонную культуру (если в среду засевали суспензию органов) и мазки-отпечатки органов, так как при этом возможны артефакты.

При окраске по Граму большинство структур Л-форм листерий грамположительны, но могут встречаться и единичные грамотрицательные структуры. Иногда при посеве в бульон изолированных бактериальных колоний листерий происходит спонтанная трансформация их в Л-форму и при окраске по Граму в мазке выявляются различной величины нередко вакуолизированные шаровидные структуры.

По чувствительности выявления Л-формы листерий в мазках-отпечатках органов и мазки культур Л-форм иммунофлюоресцентный и иммунопероксидазный методы практически равноценны. Различия их состоят в том, что в одном случае в качестве маркера антител применяют изотиоционат флюоресценна (ФИТЦ), а в другом случае - фермент пероксидазу, который выявляют с помощью 3,3-диаминобензидина тетрахлорида, при этом комплекс антиген-антитело окрашивается в темно-коричневый цвет.

Преимуществами иммунопероксидазного метода является слабое фоновое окрашивание препаратов, возможность их исследования в световом микроскопе и возможность хранения в течение длительного времени, а также возможность одновременного исследования препаратов морфологическими и иммунологическими методами.

Для выявления Л-форм листерий сферопластного типа с хорошо выраженной клеточной стенкой можно использовать сыворотку против бактериальных форм листерий, поэтому постановка реакции осуществляется в условиях любой бактериологической лаборатории. Л-формы листерий протопластного типа не выявляются антибактериальной сывороткой. Для работников научно-исследовательских учреждений в приложении 10.4. и 10.5. изложены схема получения гипериммунных сывороток против стабильных Л-форм листерий протопластного типа и метод выделения из них глобулиновой фракции, используемой в работе.

9.2.2. Окраска по непрямому методу флюоресцирующих антител (НМФА)

Для постановки реакции необходимы:

- поливалентная антибактериальная (против листерий 1-ой и 2-ой серогрупп) сыворотка кролика (для выявления бактериальных форм и Л-форм сферопластного типа) и глобулиновая фракция гипериммунной сыворотки кролика против Л-форм листерий протопластного типа (для выявления Л-форм протопластного типа);

- антитела диагностические против Jg кролика, меченные ФИТЦ;

- химически чистый ацетон;

- забуференный физиологический раствор pH 7,2-7,4;

- глицерин на забуференном физрастворе pH 7,2-7,4 (1 часть глицерина нейтрального и 9 частей забуференного физраствора);

- дистиллированная вода;

- нефлюоресцирующее иммерсионное масло или химически чистый диметилфталат;

- тонкие, обезжиренные предметные стекла.

Мазки-отпечатки из органов высушивают на воздухе и фиксируют в течение 30 минут в химически чистом ацетоне. Мазки из культуры Л-форм фиксируют на пламени. После фиксации мазки делят на две группы - на 1 этапе на одни мазки наносят поливалентную антибактериальную сыворотку кролика (в рабочем разведении), на другие наносят немеченый глобулин сыворотки кролика против Л-форм протопластного типа листерий в разведении 1:4 (глобулины разводят забуференным физраствором pH 7,2-7,4);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 1 часа;

- препараты трижды промывают в забуференном физиологическом растворе (каждое промывание по 10 минут), ополаскивают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе;

- наносят антикроличью сыворотку, меченую ФИТЦ, в рабочем (не ниже 1:16) разведении (II этап);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 30 минут;

- препараты в течение 30 минут трижды промывают в забуференном физрастворе, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе;

- на окрашенные препараты наносят глицерин на забуференном физрастворе, накрывают покровным стеклом, на которое наносят нефлюоресцирующее иммерсионное масло и исследуют в люминесцентном микроскопе.

При исследовании материала необходимо ставить контроли, указанные в таблице 8.

Таблица 8

Контроли, необходимые при постановке НМФА и НМПА

Препараты-отпечатки органов для уменьшения неспецифического свечения ткани следует окрашивать методом контрастирования. С этой целью на мазки наносят смесь люминесцирующей сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином, в соответствии с Временным наставлением по его применению. Меченый альбумин окрашивает ткани в оранжево-красный цвет.

Целесообразно сочетать просмотр препаратов одного и того же поля зрения одновременно в люминесцентном микроскопе (освещение сверху) и в фазово-контрастном устройстве (освещение снизу).

Для оценки интенсивности свечения используется четырехкрестовая система:

++++ яркая, изумрудно-зеленая люминесценция бактерий или различных по морфологии и величине структур Л-форм, часто свечение по периферии более интенсивное;

+++ отчетливо выраженная, достаточно яркая зеленая люминесценция, периферический ободок хорошо выражен;

++ недостаточно яркая желтовато-зеленоватая люминесценция, периферический ободок еле заметен;

+ люминесценция слабая, желтая.

Положительным результатом считается люминесценция клеток на 4 и 3 креста при наличии в каждом поле зрения не менее 2-5 специфически светящихся бактерий или полиморфных структур Л-форм различной величины.

9.2.3. Окраска по непрямому методу пероксидазных антител (НМПА)

Для постановки реакции необходимы:

- поливалентная антибактериальная (против листерий 1-ой и 2-ой серогрупп) сыворотка кролика и глобулиновая фракция гипериммунной сыворотки кролика против Л-форм листерий протопластного типа;

- антитела диагностические против Jg кролика, меченные пероксидазой;

- химически чистый ацетон;

- 0,5%-ный раствор перекиси водорода в метаноле;

- забуференный физиологический раствор pH 7,2-7;4;

- сыворотка крупного рогатого скота, разведенная физиологическим раствором 1:5;

- 0,05%-ный свежеприготовленный раствор 3,3 - диаминобензидина тетрагидрохлорида (ДАБ), содержащий 0,3% перекиси водорода. Приготовление раствора ДАБ: 5 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида растворяют в 10 мл забуференного физиологического раствора и добавляют 0,3% перекиси водорода в конечном разведении.

Для иммунопероксидазного исследования патологического материала из паренхиматозных органов и головного мозга готовят мазки-отпечатки. После высушивания на воздухе их фиксируют в течение 30 минут в химически чистом ацетоне. Мазки культур Л-форм фиксируют на пламени. После фиксации для инактивирования эндогенной пероксидазы препараты обрабатывают свежеприготовленным 0,5%-ный раствором перекиси водорода в метаноле в течение 30 минут;

- промывают в забуференном физиологическом растворе в течение 15 минут;

- обрабатывают в течение 10 минут сывороткой крупного рогатого скота, разведенной 1:5 (блокируют неспецифическое фоновое окрашивание ткани), высушивают фильтровальной бумагой.

Мазки делят на две группы - на 1 этапе на одни мазки наносят поливалентную антибактериальную сыворотку кролика (в рабочем разведении), на другие - немеченый глобулин антисыворотки кролика против Л-форм листерий протопластного типа в разведении 1:4 (разводят глобулины забуференным физиологическим раствором pH 7,2-7,4);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 1 часа;

- препараты трижды промывают в забуференном физрастворе (каждое промывание по 10 минут), ополаскивают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе;

- наносят в рабочем разведении антисыворотку к Jg кролика, меченную пероксидазой (II этап);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 30 минут;

- промывают забуференным физраствором и окрашивают в течение 10 минут 0,05%-ным свежеприготовленным, содержащим 0,3% перекиси водорода, раствором ДАБ;

- препараты в течение 30 минут промывают в проточной воде, заключают в бальзам и просматривают в световом микроскопе.

Контроли, необходимые при постановке реакции, указаны в таблице 8.

При положительном результате на желтоватом фоне бактериальные формы и структуры Л-форм окрашиваются в коричневый или темно-коричневый цвет.

9.3. Предварительный диагноз ставят на основании комплекса эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических и гистологических изменений, а также при наличии возбудителя в мазках-отпечатках органов.

9.4. Окончательный диагноз на листериоз устанавливают в случае выделения возбудителя (бактериальной формы, нестабильной или стабильной Л-формы). Стабильные Л-формы листерий, не давшие реверсии должны быть идентифицированы иммунофлюоресцентным или иммунопероксидазным методами.

10. ПРИЛОЖЕНИЯ

10.1. Схема лабораторного исследования на листериоз

Приложение 10.1

Схема 1